Муратова Евгения Ивановна Лекция 3 Биотехнология аминокислот

Муратова Евгения Ивановна

Лекция 3 «Биотехнология аминокислот» 1. 2. 3. 4. Способы получения аминокислот Производство лизина Производство глутаминовой кислоты и глутамата натрия Производство триптофана

ПРИМЕНЕНИЕ АМИНОКИСЛОТ В ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ Аминокислоты – пищевые добавки Повышение биологической ценности пищевых продуктов Улучшение органолептических свойств пищевых продуктов Повышение стабильности пищевых продуктов при хранении

Суточная потребность организма человека в незаменимых аминокислотах Аминокислота Химическое название Формула -CH 2 - CH – COOH | NH NH 2 Суточная потребность, г 0, 5 Триптофан α-амино-β-3 -индолпропионовая кислота Фенилаланин α-амино-β-фенилпропионовая кислота Лизин α, ε-диаминокапроновая кислота CH 2 – (CH 2 )3 – CH –COOH | | NH 2 1, 6 Треонин α-амино-β-оксимасляная кислота CH 3 – CH – COOH | | ОH NH 2 1, 0 Валин α-амино-изовалериановая кислота 1, 6 Метионин α-амино-γ-метилтиомасляная кислота CН 3–CH–CH–COOH // | СH 3 NH 2 СН 3–S–(CН 2)2–CH–COOH | NH 2 Лейцин α-амино-изокапроновая кислота СН 3 – CH – СН 2 – CH – COOH / | СH 3 NH 2 2, 2 Изолейцин α-амино-β-метилвалериановая кислота - CH 2 - CH – COOH | NH 2 СН 3 – CH 2 – СН – CH – COOH | | СH 3 NH 2 2, 2 1, 4

Мировое производство лизина Южная Корея 7% Германия 12% Другие страны 24% Япония 31% США 26%

ХИМИЧЕСКИЙ ГИДРОЛИЗ СИНТЕЗ БЕЛКОВ СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ АМИНОКИСЛОТ ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ КОМБИНИРОВАННЫЙ СПОСОБ

ХИМИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ ГЛУТАМИНОВОЙ КИСЛОТЫ СН 2=СН-CN акрилонитрил CO 2+H 2 СНO-СН 2 - СН 2 -CN βформилпропионнитрил N Н 2 СN-СН 2 - СН 2 –CH-CN α- аминоглутардинитрил Na. OH·H 2 O N Н 2 СOOH-СН 2 - СН 2 –CH-COOH NH 4 CN

ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ СИНТЕЗ ГЛУТАМИНОВОЙ КИСЛОТЫ трансамидаза I. α-кетоглутаминовая кислота+аминокислота L - глутаминовая кислота+α-кетокислота глутаматдегидрогеназа II. α-кетоглутаминовая кислота+NH 4++НАДН+ L - глутаминовая кислота+Н 2 О+НАД

ПОЛУЧЕНИЕ ГЛУТАМИНОВОЙ КИСЛОТЫ ИЗ ГЛЮТЕНА ГИДРОЛИЗОМ Пшеничная мука Отделение крахмала сушильный агент Сушка клейковины крахмал отработанный сушильный агент Измельчение клейковины HCl активированный уголь пар хладоагент Гидролиз клейковины Осветление гидролизата Концентрирование гидролизата Кристаллизация Фильтрование сушильный агент Сушка Глутаминовая кислота осадок конденсат отработанный хладоагент фильтрат отработанный сушильный агент

КОМБИНИРОВАННЫЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ЛИЗИНА СH 2 H 2 С СH 2 циклогексан HN С=O СH-NH 2 H 2 С СH 2 DL-α-амино-εкапролактамс HN рацемаза СH-NH 2 С H 2 N-CH 2(CH 2)3 -CH-COOH+ L- гидролаза NH 2 H L-лизин С=O 2 С СH 2 D-α-амино-εкапролактамс

Получение аминокислот биотрансформацией • Ферментативное расщепление D-и Lаминокислоти их производных на оптически активные изомеры. • Прямой ферментативный синтез оптически активных аминокислот, протекающий без использования энергии АТФ и других макроэргических соединений. • Ферментативный синтез оптически активных соединений, протекающий с использованием живых клеток-продуцентов.

Биосинтез лизина, треонина, метионона микроорганизмами (диаминопимелиновый путь)

ОСОБЕННОСТИ ТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО РЕЖИМА Продуценты Corynebacterium glutamicum, Brevibakterium, Micrococcus glutamicum Компоненты питательной среды Меласса, кукурузный экстракт (источник биотина), белковые гидролизаты (источники треонина и метионина), (NH 4)2 SO 4 (мочевина) KH 2 PO 4, микроэлементы, p. H 7, 2 -7, 4 Температура культивирования 28 -300 C Режим аэрации От 1 до 0, 5 м 3/м 3 мин Продолжительность культивирования 54 -72 ч (биосинтез лизина начинается после 18 ч культивирования) Содержание лизина в культуральной жидкости 25 -50 г/л

ЭСКИЗНАЯ СХЕМА ПРОИЗВОДСТВА ЛИЗИНА Посевной материал Питательная среда Стерильный воздух Биосинтез лизина Выделение биомассы из культуральной жидкости ионит раствор аммиака пар биомасса Сорбция-десорбция лизина Упаривание элюата раствор соляной кислоты Стабилизация хладоагент Охлаждение и кристаллизация конденсат 1 отработанный хладоагент

1 Фильтрация горячая вода активированный уголь Очистка лизина от примесей Фильтрация пар этанол Упаривание фильтрата осадок конденсат Кристаллизация Фильтрация сушильный агент фильтрат Сушка Готовый продукт (≥ 97% лизина) фильтрат отработанный сушильный агент

Рекомендации по выбору основного технологического оборудования для производства лизина Наименование Техническая характеристика 1. Приготовление азотно-углеводного компонента питательной среды Емкость для замачивания V=100 м 3 теплообменник, шнек, циркуляционный насос Сборник замочной воды V=63 м 3 Вальцы 5 т/час, регулируемый зазор Реактор V=63 м 3, мешалка, шнековое загружающее устройство Шнек-пресс 3 т/ч Сборник технической воды 100 м 3, мешалка Выпарная установка Q=4 т/час, термокомпрессор, (ТГ-80 -1, 6), N=100 k. W Сборник крахмального молока V=63 м 3, мешалка, N=20 k. W Крахмальный сепаратор Производительность 10 м 3/ч по исходной суспензии Гидролиз аппарат V=63 м 3, мешалка, рубашка Выпарная установка Q=4 т/ч, термокомпрессор, (ТГ-80 -1, 8), N=120 k. W Сборник влажного остатка Шнековая мешалка, V=50 м 3 Сборник азотно-углеводного V=63 м 3, мешалка, Р=0, 4 МПа

Наименование Техническая характеристика 2. Получение питательной среды для биосинтеза лизина Гидролиз-аппарат V=16 м 3 , мешалка, рубашка Биореактор V=3 м 3, мешалка, рубашка, фильтры воздуха (100 м 3/ч), Р=0, 4 МПа, аэрация регулирование to, расхода газа, система мокрой очистки газовых выбросов Установка непрерывной стерилизации 1 т/ч, рекуператор, V=0, 2 м 3 Реактор V=6, 3 м 3, мешалка, рубашка Установка непрерывной стерилизации 10 т/ч, рекуператор, V=2 м 3 Накопитель стерильной подпитки V=30 м 3, рубашка, мешалка, Р=0, 4 МПа, N=10 k. W

Наименование Техническая характеристика 3. Получение инокулята для лизина Посевной аппарат V=3 м 3, мешалка, рубашка, фильтры воздуха (100 м 3/ч), Р=0, 4 МПа, аэрация регулирование to, расхода газа, система мокрой очистки газовых выбросов 4. Получение аэрирующего газа Фильтр Масляный, производительность 10000 м 3 /ч, Р=0, 32 МПа Компрессор Производительность 10000 м 3 /ч, Р=0, 32 МПа, N=560 k. W Скруббер Производительность 10000 м 3 /ч, Р=0, 12 МПа Установка для получения СО 2 1600 кг/ч, ≥ 96% СО 2

Наименование Техническая характеристика 5. Биосинтез лизина Ферментационная установка V=143 м 3 , мешалка, рубашка, измерение р. О 2, регулирование р. Н, регулирование to, расхода газа, N=400 Kw Холодильная установка Абсорбционная, 2000 квт. Испаритель аммиака Производительность 50 кг/ч, Р=1, 2 МПа 6. Сепарация биомассы Микрофильтрационная установка 3 м 3/час, по исходной суспензии, 12000 д. , саморазгружающая Сборник V=16 м 3 7. Ультрафильтрация Ультрафильтрационная установка Производительность 1, 5 м 3 /ч, 10 КДал. 8. Упаривание пермеата Установка для упаривания пермеата Q=2 т/ч, с падающей пленкой, N=90 k. W Термокомпрессор Реконстртукция ТГ-80 -1, 6, N=100 k. W Сборник V=16 м 3 9. Получение кристаллического лизина Кристаллизатор V=10 м 3 , мешалка, рубашка Центрифуга Производительность 250 кг/ч, тип ОГШ-600 К, N=75 k. W Сушилка кормового кристаллического лизина Шнековая 75 кг/ч испаренной влаги, F=10 м 2

Схема биосинтеза глутаминовой кислоты СО 2 глюкоза изолимонная кислота изоцитратдегидргеназа НАДФ L-глутаминовая кислота НАД·Н(+Н+) а-кетоглутаровая кислота глутаматдегидрогеназа NН 4+

ОСОБЕННОСТИ ТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО РЕЖИМА COOH-CH 2 -COOH NH 2 Глутаминовая кислота COOH-CH 2 -COONa NH 2 Глутамат натрия Продуценты Corynebacterium glutamicum Brevibakterium flavum Компоненты питательной среды Меласса (органические кислоты, углеводы), мочевина, кукурузный экстракт, Mg. SO 4, Mn. SO 4, K 2 HPO 4, KH 2 PO 4, Ca. CO 3, БАВ (тиамин, биотин, антибиотики) p. H 7 -7, 2 Температура культивирования 28 -300 C Режим аэрации 40 -45 г О 2 м 3/мин Продолжительность культивирования 48 -54 ч Содержание глутаминовой кислоты 40 -50 г/л

Эскизная схема производства глутаминовой кислоты Посевной материал Питательная среда Стерильный воздух Биосинтез Выделение биомассы из культуральной жидкости пар HCl хладоагент Выпаривание фугата до 40 -50% СВ Кристаллизация глутаминовой кислоты Центрифугирование 1 биомасса конденсат отработанный хладоагент фугат

1 горячая вода активированный уголь Очистка кислоты от примесей Фильтрация хладоагент Перекристализация Центрифугирование сушильный агент Сушка кристаллов Готовый продукт (99% глутаминовой кислоты) осадок отработанный хладоагент фугат отработанный сушильный агент

1 Na. OH теплоноситель активированный уголь Нейтрализация до p. H 6, 8 Фильтрация пар Выпаривание осадок конденсат сушильный агент Кристаллизация отработанный хладоагент Центрифугирование хладоагент фугат Сушка кристаллов Глутамат натрия отработанный сушильный агент

Получение аминокислот биотрансформацией из предшественников Предшественник Продукт α-Кетоизокапроновая кислота L-лейцин α-Кетомасляная кислота, D-треонин L-изолейцин Индол, глицин L-триптофан Антраниловая кислота L-серин, L-триптофан, L-фенилаланин

Схема биосинтеза триптофана +фосфорибозилпирофосфат антраниловая кислота N-(5’-фосфорибозил)-антраниловая кислота триптофансинтетаза серин индол-3 -глицерофосфат глицеральдегид -3 -фосфат триптофан

Особенности технологического режима COOH CH 2 -CH-NH 2 N H триптофан Продуценты Candida utilis, Escherichia coli (Bacillus subtilis) Компоненты питательной среды Меласса, мочевина, K 2 HPO 4, Mg. SO 4, Ca. Cl 2, антраниловая кислота Температура культивирования 28 -300 C Режим аэрации От 7 г О 2 /(л·ч ) до 3 -4 г О 2 /(л·ч) Время культивирования 144 ч (24 ч – накопление биомассы, 120 ч – биосинтез триптофана из предшественника) Содержание триптофана 6 г/л

Применение аминокислот Аминокислота Область применения L-глутаминовая кислота и ее соли Вкусоароматическая добавка (усилитель вкуса) в производстве консервов, пищеконцентратов, кулинарных изделий, готовых блюд. Лизин Повышение пищевой ценности (обогащение) хлебобулочных и макаронных изделий, антиоксидант. Аспартам Подсластитель в производстве безалкогольных напитков, кондитерских изделий, жевательной резинки. Позволяет значительно снизить калорийность без изменения вкусовых качеств. Метионин, фитин Антиоксиданты, замедляющие прогоркание триптофан, глицин жиров. Используют в производстве молочных аргинин, аспарагин, концентратов и масложировой продукции. Цистеин Вкусоароматическая добавка (имитатор вкуса и аромата мяса), антиоксидант.