Молекулярные механизмы рекомбинации и мигрирующие генетические элементы микроорганизмов Лекция № 6 Для студентов специальности «Микробиология» по дисциплине «Генетика микроорганизмов»
План лекции: n n n n Типы генетической рекомбинации. Общая (гомологичная) рекомбинация. Сайт-специфическая рекомбинация. Незаконная рекомбинация Мобильные генетические элементы микроорганизмов. Инсерционные последовательности (Is) и транспозоны (Tn) бактерий. Мигрирующие элементы и естественный отбор. Горизонтальный перенос генов и его роль в эволюции бактерий. Классификация и структура. Молекулярные механизмы транспозиции. Репликативная и нерепликативная транспозиция.
Молекулярные механизмы рекомбинации
Типы рекомбинации – возникновение новых последовательностей ДНК за счёт разрывов и п Рекомбинация может происходить у эукариот, у бактерий и даже при размножении вир n Общая или гомологичная n Сайт-специфическая или незаконная n Случайная или негомологичная
Гомологичная рекомбинация (1903/1919) Модель Холлидея n В 1964 году американским генетиком Р. Холлидеем была опубликована общая модель кроссинговера.
Гомологичная рекомбинация (1903/1919) Общая схема гомологичной рекомбинации профазе 1 -го А) Кроссинговер в n n Синий и красный цвет – гомологичные молекулы, вертикальные линии- центромеры. Кроссинговер обозначен знаком "X". деления мейоза. Кроссинговер произошел между двумя внутренними хроматидами. Продукты кроссинговера - две рекомбинантные и две нерекомбинантные хроматиды. Б) Кроссинговер в соматической клетке на стадии G 1 клеточного цикла (клетки прошли через митотическое деление, но у них не произошла репликация хромосом). В) Кроссинговер в клетке Escherichia coli. Одна из клеток (реципиент), имеющая кольцевую хромосому (красная), получила от клетки-донора линейный фрагмент двуцепочечной ДНК (синий). В‘) Единичный кроссинговер только на одном конце фрагмента привел бы к гибельному для реципиентной клетки разрыву хромосомы
Гомологичная рекомбинация (1903/1919) Гомологичная рекомбинация Гомологичная рекомбина -обмен участками между гомологичными молекулами ДНК. Новых последовательностей не создаётся, а перетасовываются уже имевшиеся сходные варианты одной и той же последовательности
Ферменты рекомбинации Rec. ВСD-нуклеаза n n n n n Rec. BCD-нуклеаза - один из самых ранних белков рекомбинации Субъединицы кодируются генами rec. B, rec. C и rec. D. Rec. BCD может гидролизовать одно- и двуцепочечную ДНК, имеет также хеликазную активность, то есть расплетает дуплекс ДНК. Фермент работает как сайт-специфическая эндонуклеаза: расщепляет одноцепочечную ДНК около особой 8 -нуклеотидной последовательности, называемой Chi-сайтом. Расплетает дуплекс, образуя одноцепочечную ДНК (D-петля) Продвигается вдоль ДНК до Сhi-сайта Разрывает 3’-цепь Rec. А формирует филамент, D-петлю, полухиазмы. D-петля разрезается с помощью одной из эндонуклеаз E. coli, что приводит к полухиазме Холлидея. Rec. BCD удаляет 5’-конец ДНК-полимераза и ДНК-лигаза застраивают бреши и разрывы SSB-белок выпрямляет одноцепочечную ДНК
Ферменты рекомбинации Rec. A-белок n n n Приводит во взаимодействие одноцепочечную ДНК с гомологичными дуплексами. Размер (около 38 к. Д) и проявляет разнообразные активности. Требуются в качестве кофакторов АТФ и одноцепочечная ДНК в любой форме. Наличие двух сайтов связывания с ДНК. Первый сайт используется для первичного связывания с ДНК: в присутствии АТФ белок всегда взаимодействует в этом сайте с одноцепочечной ДНК. Реакции, составляющие следующую, синаптическую стадию кроссинговера, происходят только внутри филаментов, которые могут вступать в рекомбинацию только с "голой", не находящейся в филаменте ДНК. Взаимодействие филамента с голой ДНК осуществляется за счет второго сайта связывания Rec. A, контакт слабый. Эти контакты становятся прочными только после встречи гомологичных последовательностей.
Ферменты рекомбинации Стадии рекомбинации n n n Rec. A-белок связывается с одноцепочечной ДНК, образуя Rec. A-ДНК-филамент Филамент взаимодействует с «голой» ДНК, нахождение гомологичных последовательностей, образование D-петли Удаление гетеродуплекса путём миграции ветвления
Структуры Холлидея Структура Холлидея или полухиазма Промежуточное соединение, где происходит комплементарное спаривание между одноцепочечными участками, принадлежащими разным родительским цепям ДНК Образуются гетеродуплексные районы Изображения полухиазм получены в электронном микроскопе
Разрезание полухиазмы Миграция и разрезание полухиазмы n n Последующие этапы - миграцию ветвления и разрешение полухиазмы осуществляют белки: Ruv. A, Ruv. B и Ruv. C - продукты генов ruv. A, ruv. B и ruv. C. Ruv. A узнает крестообразную полухиазму и нацеливает на нее Ruv. B. Последний узнает комплекс Ruv. A-полухиазма и, используя энергию АТФ и работая как ДНКхеликаза, осуществляет миграцию полухиазмы в том же направлении, что и Rec. A-белок in vitro. Резолваза Ruv. C узнает комплекс Ruv. Bполухиазма, связывается с ним. На этом миграция полухиазмы прекращается.
Структуры Холлидея Миграция ветви Полухиазма подвижна и может перемещаться вдоль цепи ДНК
Разрезание полухиазмы
Модель Жостака В последние годы получила развитие модель, предложенная еще в 1983 году Дж. Жостаком и др. для репарации двуцепочечных повреждений ДНК у дрожжей.
Сайт-специфическая рекомбинация n n n Происходит между специфическими сегментами дуплексов ДНК, не имеющими протяженных гомологичных участков. Характерным примером такой рекомбинации служит встраивание кольцевой ДНК фага λ в хромосому Е. coli и ее обратное выщепление. При интегрирование ДНК фага лямбда в хромосому E. coli в случае лизогенного пути развития фага происходит образование сложно структурированного нуклеопротеинного комплекса, т. н. интасомы.
Сайт-специфическая рекомбинация Рекомбинация происходит в пределах специфической нуклеотидной последовательности ДНК фага λ (att. P-сайт) и уникальной последовательности ДНК Е. coli (аtt. В-сайт). Нуклеотидные последовательности att. P- и att. Всайтов совершенно различны, хотя имеют общее ядро (О) протяженностью в 15 нуклеотидных пар. Att. P (POP') простирается на 150 нуклеотидов влево (Р) и на 75 нуклеотидов вправо (Р') от общего ядра, a att. B (BOB') – это сегмент длиной всего около 25 нуклеотидов, включая и ядро. Поскольку нуклеотидные последовательности, фланкирующие att. P- и att. В-сайты слева (att. L) и справа (att. R), для этих сайтов различаются, механизм рекомбинационного выщепления ДНК фага λ из ДНК Е. coli должен отличаться от механизма их рекомбинационной интеграции. Для рекомбинации между att. L и att. R при исключении фаговой ДНК помимо белка Int необходимы фаговый белок xis и клеточный белок HF. Процесс рекомбинационного выщепления, повидимому, имеет некоторое сходство с процессом интеграции, но роль указанных трех белков, особенно белка xis, все еще изучается.
Незаконная рекомбинация (1982) Незаконная рекомбинация n n - рекомбинация между негомологичными нуклеотидными последовательностями происходит в клетках прокариот и дрожжей достаточно редко, а в клетках млекопитающих – весьма часто. К негомологичной рекомбинации можно отнести процесс случайного встраивания вирусной или плазмидной ДНК в ДНК клеток животных, в результате чего в реплицирующихся геномах появляется множество делеций и дупликаций.
Мигрирующие генетические элементы микроорганизмов
Открытие транспозонов и инсерционных вставок n n n Транспозоны впервые были открыты в 40 -х годах американской ученой Барбарой Мак-Клинток у кукурузы. Эти гены, индентифицированные по их способности подавлять экспрессию других генов кукурузы, находящихся рядом с ними, не имели фиксированного положения в хромосоме. Они как бы передвигались по всему геному растения. Регуляторные элементы могли встраиваться и выщепляться, причем после их выщепления зачастую начинали функционировать ранее молчащие гены. Оказалось, что гены, ассоциированные с регуляторными элементами, становились нестабильными и часто мутировали из-за нестабильности самих этих элементов. В течение многих лет кукуруза оставалась единственной системой, в которой обнаруживались такие подвижные генетические элементы. Сейчас - и у бактерий, дрозофил и других организмов. Инсерционные последовательности были открыты в начале 1970 -х гг. П. Старлинжером, Г. Седлером и Дж. Шапиро при изучении мутаций необычного типа у E. coli.
Мобильные генетические элементы n n Подвижные генетические элементы входят в состав бактериальной хромосомы и плазмид. К ним относятся инсерционные последовательности и транспозоны. Бактериальные транспозоны обозначаются буквами Tn, инсерционные вставки - Is, за которыми следует номер типа. Они могут инактивировать гены, в которые включились ( «выключение» гена) или, встраиваясь в хромосому, проявлять эффект промотора, включающего или выключающего транскрипцию соответствующих генов; повышают частоту делеций и инверсий, приводят к транслокациям и образованию коинтегратов. Некоторые бактериофаги фактически являются транспозонами или транспозиционными бактериофагами (transposing bacteriophages). Например, бактериофаг Mu является очень большим транспозоном (38000 н. п. ), который кодирует не только ферменты, ответственные за транспозицию, но также и большое число структурных белков, необходимых для упаковки его ДНК.
Классификация основана на структурных особенностях: инсерционые вставки, простые транспозоны, сложные (композитные) транспозоны
Инсерционные последовательности n Вставочные или инсерционные последовательности ( Is элементы) представляют собой участки ДНК, способные перемещаться из одного места локализации в другое, и содержат только гены, необходимые для перемещения. Имеют длину около 1 -2 тысяч пар нуклеотидов.
Транспозоны n Транспозоны ( Tn ) - это сегменты ДНК, состоящие из вставочных последовательностей и структурных генов, обеспечивающих синтез молекул со специфическими биологическими свойствами (токсичность, устойчивость к антибиотикам и др. ) длиной от 3 до 20 т. н. п. . Транспозоны не способны к самостоятельной репликации и размножаются только в составе бактериальной хромосомы.
Перемещение транспозонов n n n ДНК переносится ферментом транспозазой. Фермент кодируется последовательность длиной около 20 нуклеотидов в середине транспозона. Он специфически взаимодействует с концевыми инвертированными повторами мобильного элемента и может вырезать его из хромосомы. Вырезание может происходить точно – с восстановлением исходной структуры участка ДНК, и неточно, то есть с делециями и вставками от одного до нескольких нуклеотидов.
Перемещение транспозонов n n Механизмы транспозиции: Репликативная в реципиентной и донорной ДНК происходят одноцепочечные разрывы, воссоединение с образованием коинтеграта при участии транспозазы, репликация и рекомбинация, диссоциация коинтеграта под действием резолвазы.
Перемещение транспозонов n Нерепликативная (консервативная, простое встраивание) двуцепочечные разрывы в реципиенте и мобильном элементе, соединение концов (образуются одноцепочные фланкирующие последовательности, с этим связана дупликация сайтамишени размером 3 -12 нуклеотидов).
Биологический смысл n n n Поскольку подвижные гены могут перемещаться в пределах генома с одного места на другое, то они могут быть весьма эффективными векторами для передачи рекомбинантной ДНК. Генетическая трансформация с помощью векторов на основе транспозонов была впервые осуществлена на дрозофиле. Поведение транспозонов можно расценить как паразитическое. Большинство их перемещается изредка, но, так как их в клетке довольно много, транспозиция оказывает значительное влияние на разнообразие видов. Биологический смысл перемещения отдельных сегментов ДНК: - прерывание соответствующего гена, что ведет к эволюции; - регуляция деятельности генов.
Скачать презентацию Молекулярные механизмы рекомбинации и мигрирующие генетические элементы микроорганизмов
Лекция 6 ГМ исп.ppt