Молекулярно-генетический метод диагностики наследственных заболеваний. ДНК-диагностика.
Молекулярно-генетические методы - это большая и разнообразная группа методов, в конечном счете предназначенном для выявления вариаций в структуре исследуемого участка ДНК (аллеля, гена, региона хромосомы) вплоть до расшифровки последовательности оснований.
В основе этих методов лежат манипуляции с ДНК и РНК. В результате бурного развития молекулярной генетики человека в 70 -80 -х годах и последуещего успешного изучения генома человека молекулярно-генетические методы широко вошли в медикигенетическую практику.
Получение образцов ДНК (или РНК) является исходным этапом всех методов. Этот этап реализуется в двух вариантах: а) выделение всей ДНК (тотальной или геномной) из клеток; б) накопление определенных фрагментов, которые предполагается анализировать с помощью полимеразной цепной реакции.
Источником геномной ДНК могут быть любые ядросодержащие клетки. Выделенная из клеток ДНК представляет собой весь геном организма. Поэтому такие образцы называются геномной ДНК. На практике чаще используют периферическую кровь (лейкоциты), хорион, амниотические клетки, культуры фибробластов.
Для одного анализа необходимо иметь (в зависимости от используемого метода) от нескольких нанограммов до нескольких микрограммов ДНК.
Полимеразная цепная реакциия. Рестрикция ДНК на фрагменты является необходимым этапом в молекулярногенетической диагностике. Этот процесс осуществляется рестриктазами , относящимся к группе бактериальных эндонуклеаз. При обработке геномной ДНК рестриктазой получается закономерный для данного фермента набор фрагментов различной длины.
Электорфорез фрагментов ДНК обеспечивает разделение этих фрагментов при их распределении на поверхности агарозного или полиакриламидного геля. Фрагменты ДНК движутся в геле, помещенном в постоянное электрическое поле, от отрицательного полюса к положительному в зависимости от размеров (чем больше относительная молекулярная масса фрагмента, тем медленнее он движется в электрическом поле.
После окончания электрофореза каждый фрагмент ДНК занимает определенное положение в виде дискретной полосы в конкретном месте геля. Длину каждого фрагмента можно определить путем сравнения пройденного фрагментом расстояния с расстоянием, пройденным стандартным образцом ДНК с известными размерами.
Прямая диагностика мутаций включает несколько методов: -определение нуклеотидной последовательности - выявление нарушения места рестрикции -альспецифическую гибридизацию с синтетическими олигонуклеотидными зондами - химическое и ферментативное расщепление ДНК в местах неправильного сшивания оснований - регистрацию изменения электрофоретической подвижности мутантных молекул ДНК - трансляцию белкового продукта in vitro.
Метод нуклеотидной последовательности . Непосредственная диагностика патологических мутаций путем определения нуклеотидной последовательности является наиболее точным. Она позволяет достоверно выявлять замены оснований, делеции и вставки на всем протяжении изучаемого фрагмента. поскольку трудоемкость секвенирования еще большая, стоимость высокая, то эти обстоятельства частично ограничивают применение этого варианта прямой детекции мутаций. Однако развитие автоматизации секвенирования позволяет надеяться, что в будущем этот метод займет ведущее место.
Выявления мутаций по нарушению рестрикции осуществляется с помощью блот-гибридизации по Саузерну. При обработке соответствующей рестриктазой в геле отсутствуют фрагмент ДНК, выявляемый у нормальных индивидов. Примерно 50% нуклеотидных замен приводит к изменению места (или сайта) рестрикции, благодаря чему возможна прямая детекция мутаций на основе рестриктного анализа.
Аллельспецифическая гибридизация выявления мутаций гибридизацией с зондом позволяет обнаруживать мутации в геномной ДНК. Последовательность оснований в олигонуклеотидном зонде может быть задана по нормальному или патологическому варианту гена, затем помечена. И в том, и в другом случае такой зонд используется для гибридизации с фрагментов ДНК обследуемого индивида.
Выявления мутаций по расщеплению ДНК Химическое (или ферментативное) расщепление ДНК в местах неправильной сшивки оснований выявляет большую группу мутаций, ведущих к нестабильности ДНК. Мутации в молекуле ДНК могут изменять электрофоретическую подвижность фрагмента ДНК.
Во-первых, могут изменяться температурные показатели плавления двухцепочечных фрагментов, что можноопределить с помощью электрофореза двухчепочечной ДНК в градиентном денатурирующем геле (так называемый денатурирующий гельэлектрофорез).
Во-вторых, в результате мутации изменяться конформация одночепочечных фрагментов, что выявляется путем электрофореза предварительно денатурирующих ДНК в неденатурирующих условиях.
В-третьих, проводиться так называемый гетеродуплексный анализ, с помощью которого обнаруживаются нарушения линейности гетеродуплексов в местах коротких вставок и делеций. Суть этого варианта электрофорез двухцепочечной ДНК в нейтральном или равномерно денатурирующем геле.
Выявления мутаций по трансляции белков Трансляция белкового продукта осуществляется в системе in vitro на основе полученной специфической м. РНК с добавлением лизата ретикулоцитов (в нем содержатся все необходимые компоненты для синтеза белка). В этой системе синтезируется белковый продукт соответствующего гена. Продукт трансляции анализируют с помощью электрофореза. Изменение электрофоретической подвижности белка свидетельствует о наличии мутации (нонсенс-мутация, нарушение сплайсинга РНК, сдвиг рамки считывания).
Косвенные методы выявления мутаций применяется в тех случаях, когда нуклеотидная последовательность гена еще неизвестна и вместе с тем имеется информация об относительном положении ге на на генетической карте. Фактически это соответствует диагностике с помощью метода сцепления генов. Технические приемы в косвенной диагностике те же самые, что и в прямой диагностике (получение ДНК, рестрикция, электрофорез и т. д. ). Естественно, к этому добавляется математический анализ сцепления признаков.
Спасибо за внимание!!
Скачать презентацию Молекулярно-генетический метод диагностики наследственных заболеваний ДНК-диагностика Молекулярно-генетические
мед.генетика Борисевич Оля.pptx