Молекулярно-генетические механизмы инициации цветения ГЕНЕТИКА РАЗВИТИЯ РАСТЕНИЙ кафедра

Молекулярно-генетические механизмы инициации цветения «ГЕНЕТИКА РАЗВИТИЯ РАСТЕНИЙ» кафедра генетики и биотехнологии СПб. ГУ 1

Регуляция различных этапов развития цветка вегетативная меристема побега генеративная меристема соцветия меристема цветка органы цветка Температура Гормоны, сахара Гены, контролирую щие время цветения Стресс Длина светового дня Циркадные ритмы Гены идентичности флоральной меристемы Гены идентичности органов цветка 2

Генетическая регуляция цветения у A. thaliana Гены, контролитрующ ие инициацию цветения Blázquez, 2001

Влияние различных факторов на инициацию цветения Длина светового дня Циркадные ритмы Инициация цветения Температура Гормоны, сахара 4

Открытие фотопериодизма у растений: 5

Гипотеза «флоригена» Флориген - гормон цветения, термин предложен М. Х. Чайлахяном, 1936 Гипотеза: флориген синтезируется в листьях и перемещается в апекс. Его синтез регулируется светом. Опыты Чайлахяна с дурнушником (Xanthium strumarium) Современные представления: флориген (FT) – центральный регулятор ВСЕХ путей контроля цветения 6

Влияние различных факторов на инициацию цветения Длина светового дня Циркадные ритмы Инициация цветения Температура Гормоны, сахара 7

Классификация растений в зависимости от их фотопериодической реакции 1. Растения короткого дня (кукуруза, рис и др. ) 2. Растения длинного дня (арабидопсис, пшеница, овес, рожь и др. ) 3. «Нейтральнодневные» растения 8

Фотопериодическая регуляция инициации цветения свет красный свет синий свет Гены, регулирующие цветение фитохромы (PHYB, PHYD, PHYE) CONSTANS криптохромы FLOWERING LOCUS T (CRY 1, CRY 2) LHY CCA 1 + FD LEAFY TOC 1 «циркадные часы» 9

Основные компоненты «циркадных часов» растений день LHY CCA 1 TOC 1 ночь LHY – LATE ELONGATED HYPOCOTYL CCA 1 – CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED TOC 1 – TIMING OF CAB 1 10

«Циркадные ритмы» растений Активность люциферазы у растений CAB: : LUC (CAB - chlorophyll a/b-binding protein) 11

Регуляция инициации цветения: модель «совпадения» (coincidence model) Гены, регулируемые циркадными часами короткий день длинный день Их продукт – ТФ, активируемый светом Гены, регулирующие цветение Imaizumi and Kay. , TRENDS in Plant Science 2006

Ген CONSTANS (CO) в регуляции инициации цветения Фенотип мутантов co и трансгенных растений со сверхэкспрессией CO WT co WT 35 S: : CO Ген CO – кодирует предполагаемый ТФ с доменами «цинковые пальцы»

Экспрессия гена CONSTANS (CO: : GUS) в проводящих тканях An et al. , Development 2004

Динамика экспрессии гена CONSTANS в течение суток Длинный день Короткий день Время день ночь Цветение Нестабильность белка Ночь CO в темноте День Экспрессия CO: : CO–YFP 15

Фотопериодическая регуляция активности CO КОРОТКИЙ ДЕНЬ м. РНК CO Темновая деградация белок CO ДЛИННЫЙ ДЕНЬ м. РНК CO белок CO 16

Фотопериодическая регуляция активности CO 17

Фотопериодическая регуляция активности CO цветение криптохромы (CRY 1, CRY 2) COP 1 Убиквитин -лигаза CO protein синий свет Криптохромоподобный белок (FKF 1) Убиквитин -лигаза CDF CO m. RNA Репрессор транскрипции 18

COP 1 опосредует убиквитин-зависимую деградацию белка CO 19 Liu et al. , Plant Cell 2008

COP 1 опосредует убиквитин-зависимую деградацию белка CO: исследование взаимодействия белков COP 1 и CO Двугибридная дрожжевая система Анализ связывания in vitro Колокализация белков in vivo Анализ убиквитинирования in vitro FRET – fluorescence resonance energy transfer - резонансный перенос энергии флуоресценции 20 Liu et al. , Plant Cell 2008

СОР 1 опосредует темновую деградацию белка СО

Молекулярные механизмы «гипотезы совпадения» Регуляция на уровне м. РНК СО: • • • FKF 1 (FLAVIN-BINDING KELCH REPEAT FBOX 1) – Fbox-содержащий криптохромподобный белок GI (GIGANTEA) – активатор FKF 1 CDF (CYCLING DOF FACTORS)– репрессоры транскрипции Регуляция на уровне белка СО: • СОР 1 (CONSTITUTIVE PHOTOMORPHOGE- - Fboxсодержащий белок NESIS 1)

Выявление мишеней CONSTANS Анализ экспрессии генов у мутантов co показал изменение характера экспрессии гена FT FLOWERING LOCUS T (FT) – предполагаемая мишень CO FT - белок 20 к. Да, имеет гомологию с Raf-киназным ингибитором или фосфатидилэтаноламин связывающим белком 23

FT – FLOWER LOCUS T - мишень CONSTANS КОРОТКИЙ ДЕНЬ м. РНК CO белок CO м. РНК FT ДЛИННЫЙ ДЕНЬ м. РНК CO белок CO м. РНК FT 24

Продукт гена FT (м. РНК, белок-? ) – транспортируется из листа в апекс побега, где инициирует цветение Imaizumi and Kay. , TRENDS in Plant Science 2006

Продукт гена FT (м. РНК, белок-? ) – транспортируется из листа в апекс побега, где инициирует цветение Активация экспрессии FT (HSP: : FT) тепловой шок цветение Hsp: : GUS Содержание транскриптов FT и GUS (контроль) в апексе побега после индукции конструкций Hsp: : FT и Hsp: : GUS тепловым шоком (ТШ) GUS FT м. РНК FT белок FT лист ТШ ТШ апекс побега ? 26 Huang et al. Science 2005

Белок FT транспортируется из листа в апекс побега, где инициирует цветение В работе Huang et al. Science 2005 – некорректный анализ данных по содержанию транскриптов FT в апексе (Real-time PCR) гибридизация РНК in situ: отсутствие транскриптов FT в апексе побега http: //4 e. plantphys. net/article. php? ch=25&id=398 Передвижение белка Myc FT в апекс побега 27 Jaeger and Wigge Current Biology 2007

Белок FT (флориген) транспортируется из листа в апекс побега, где инициирует цветение 28

Фотопериодическая регуляции цветения у растений длинного дня и растений короткого дня 29 http: //4 e. plantphys. net/article. php? ch=25&id=398

Фотопериодическая регуляция активности CO и FT 30

Основные гены, контролирующие фотопериодическую индукцию цветения у длиннодневного растения Arabidopsis thaliana (А) и короткодневного растения Oryza sativa (Б) Гены – ортологи выделены одинаковыми фигурами (по Greenup et al. , 2009 с изменениями) 31

Ген TFL (Terminal Flower) арабидопсиса Продукт гена TFL – белок - репрессор цветения, на 60% сходный с FT По функции - АНТИФЛОРИГЕН

TFL 1 – имеет 59% сходства с белком FT FD+TFL 1 Замена одной аминокислоты в FT и TFL 1 влияет на способность FD активировать/репрессировать транскрипцию генов-мишеней FD FD активация репрессия транскрипции генов-мишеней SOC 1, AP 1, . . LFY репрессия активация транскрипции 33

Белки семейства FT/TFL у разных видов семенных растений

Дополнительная функция FT – контроль образования клубней картофеля 35

Выявление мишеней FT: Изучение влияния мутаций по различным генам, контролирующих инициацию цветения, на фенотип трансгенных растений 35 S: : FT Мутация fd-1 супрессирует проявление сверхэкспрессии FT (35 S: : FT) FT FD (FLOWERING LOCUS D) 36 Abe et al. , SCIENCE 2005

Экспрессия FD (FD: : GUS) в апексе побега Ген FD кодирует транскрипционный фактор семейства b. ZIP 37 Abe et al. , SCIENCE 2005

Передача сигнала флоригена FT: FAC (Florigen Activating Complex) Участники: 1. Белки семейства 14 -3 -3 2. Транскрипционный фактор FD Taoka et al. , 2013

Выявление мишеней FT FT SOC 1 (SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1) 39

Функции ТФ SOC 1 гиббереллины CO FT + FD SOC 1 FLC LFY + AGL 24, 71, 72 Органы цветка ТФ с MADS доменом, центральный координатор генеративного развития SOC 1 экспрессируется в меристеме соцветия Экспрессия SOC 1 подавляется после закладки органов цветка 40

Мишени ТФ SOC 1 41

C промотором SOC 1 связываются димеры «цветочных» ТФ MADS, подавляя его экспрессию SOC 1 SEP 3, SEP 1, 2, 4 AP 1, AP 2 AP 3, PI AG, AGLs 42

Схема регуляции цветения у растений с участием ТФ SOC 1 43 http: //4 e. plantphys. net/article. php? ch=25&id=398

Влияние различных факторов на инициацию цветения Длина светового дня Циркадные ритмы Инициация цветения Температура Гормоны, сахара 44

Антагонизм этилена и гиббереллинов в регуляции цветения гиббереллины цветение этилен 45 Achard et al. , PNAS 2007

Роль гиббереллинов в индукции цветения GA LFY SOC цветение FT

Влияние различных факторов на инициацию цветения Длина светового дня Циркадные ритмы Инициация цветения Температура Гормоны, сахара 47

Влияние температуры на инициацию цветения Вернализация – продолжительное воздействие низких температур (как правило, 1 -7 °С в течение 1 -3 месяцев), необходимое для инициации цветения у некоторых видов растений 48 Henderson and Dean Development 2004

Молекулярные основы эпигенетических изменений: 1. метилирование ДНК 2. модификация структуры хроматина: ü изменение уровня метилирования и ацетилирования гистонов ü группа Polycomb- белков 3. РНК-сайленсинг (микро. РНК (mi. RNAs) и малые интерферирующие РНК (si. RNAs))

Факторы, регулирующие инициацию цветения по пути вернализации: Репрессор цветения FLC – FLOWER LOCUS C –ТФ семейства MADS Белки VERNALIZATION (VRN) и VERNASLISATION-INDEPENDENT (VIN) репрессия транскрипции гена FLC при вернализации VRN 1 - ДНК-связывающий Myb-белок VRN 2 - белок Polycomb-группы, обладающий гистон-метил-трансферазной активностью VIN 3 – компонент гистон-деацетилазного переход к цветению комплекса Белок FRIGIDA (FRI) основа гистон-деметилазного комплекса H 3 K 27 me 3, мишень – Lys 27 гистона H 3 FRI FLC VRN 1, 2, VIN 3, PRC 2 -CLF активация транскрипции гена FLC FT SOC 1 50

Эпигенетическая регуляция активности гена FLC с участием белков VRN Деацетилирование гистона H 3 Метилирование лизинов K 9 и K 27 гистона H 3 51 Sung, Amasino. Curr Opin Plant Biol 2004

Регуляция уровня транскриптов FLC: метилирорвание /де-метилирование гистонов, антисенс-РНК COOLAIR FCA, FY FCA+FY – факторы процессинга РНК, регулируют стабильность COOLAIR 52

Белки Polycomb-группы подавляют транскрипцию генов, изменяя структуру хроматина Drosophila melanigaster Arabidopsis thaliana POLYCOMB комплекс обладает гистон – метилтрансферазной активностью (метилирует Lys 9 и Lys 27 N-конца Н 3) Chanvivattana et al. , Development 2004

Взаимодействие комплекса PRC 2 с другими белками (а) – только PRC 2 комплекс неполное подавление экспрессии (b) – присоединение белков-кофакторов полное подавление экспресии (с) – присоединение комплекса PRC 1 стабилизация подавления экспрессии (d) – присоединение комплекса trx. G снятие репрессии

Регуляция экспрессии FLC с помощью эпигенетических механизмов 55 Jarillo et al. , 2009

Активация экспрессии FLC (в эмбриональном развитии) ARP 6 Гистон H 2 A. Z H 3 K 4 Me TRITHORAX 1 (ATX-1) 56 Jarillo et al. , 2009

Участие некодирующих РНК в подавлении экспрессии FLC COOLAIR (COLD INDUCED LONG ANTISENSE RNA) – антисенс FLC COLDAIR (COLD ASSISTED INTRONIC NONCODING RNA) – считывается с 1 интрона FLC

Участие некодирующих РНК в подавлении экспрессии FLC Рекрутирует PRC 2 COLDAIR COOLAIR Рекрутирует деметилазу H 3 K 4 me 2/3 58 Grimanelli and Roudier, 2013

COLDAIR рекрутирует компоненты PRC 2 (Polycomb repression complex 2) к локусу FLC, опосредуя его стабильную репрессию COLDAIR– (long non-coding RNA – lnc. RNA) ü транскрибируется с 1 -го интрона локуса FLC (cold assisted intronic noncoding RNA) ü размер около 1100 н. Активация экспрессии COLDAIR при вернализации 59 Heo et al. , 2011

Регуляция экспрессии с участием комплексов Thrithorax, Polycomb и длинных некодирующих РНК Arabidopsis млекопитающие 60

Основные гены идентичности цветковых меристем у A. thaliana - LEAFY (LFY ) - APETALA 1 (AP 1) - CAULIFLOWER (CAL ) - UNUSUAL FLORAL ORGANS (UFO)

Мутации, нарушающие функцию генов, отвечающих за образование цветочной меристемы, приводят к замене цветков на побеги (гомеозисные мутации) wt floricaula Antirrhinum majus wt falsiflora Lycopersicon esculentum Нормальные аллели этих генов отвечают за метаморфоз побегов в цветки в соответствии с классической теорией Гете

Фенотип мутации lfy у арабидопсиса дикий тип lfy

Экспрессия гена LFY у арабидопсиса Слабый уровень экспрессии гена LFY наблюдается и на вегетативной стадии развития (в АМ и листовых примордиях) На репродуктивной стадии экспрессия усиливается (достигает порогового уровня) и сосредотачивается по бокам АМ (в участках заложения ФМ)

Фенотип трансгенных растений 35 S: : LFY служит дополнительным подтверждением роли LFY в формировании ФМ У растений 35 S: : LFY ген LFY экспрессируется и в АМ, что приводит к ее превращению во ФМ и формированию терминальных цветков (закрытию соцветия)

Ортологи гена LFY FLORICAULA (FLO) – Antirrhinum majus NFL – Nicotiana tabacum ALF – Petunia hybrida FALSIFLORA – Lycopersicon esculentum UNIFOLIATA (UNI) – Pisum sativum ELF 1 – Eucalyptus globules NEEDLY (NLY) - Pinus radiata

Характер экспрессии генов-ортологов LFY/FLO определяет тип соцветия (открытое или закрытое) открытое закрытое LFY Antirrhinum Arabidopsis табак томат

Ген сосны NEEDLY под промотором гена LFY супрессирует мутацию lfy-26 LFY: : NLY

Наличие ортологов генов LFY/FLO у голосеменных и покрытосеменных растений позволяет предполагать, что эти гены участвовали в возникновении репродуктивных органов у предковых форм семенных растений Зависимость структуры побега (открытый/закрытый) от особенностей экспрессии ортологов LFY/FLO свидетельствуют о том, что генетически обусловленные изменения характера экспрессии этих генов могли оказывать существенное влияние на эволюцию структуры соцветия

Ген TFL 1 – антогонист гена LFY. Его экспрессия препятствует экспрессии LFY в АМ. При мутации tfl 1 ген LFY начинает экспрессироваться и в АМ, превращая соцветие в закрытое (как в растениях 35 S: : LFY) Экспрессия LFY

Связь между структурой соцветия (открытое/закрытое) и особенностями экспрессии генов антогонистов – ортологов LFY и TFL 1 в меристеме соцветия 72

APETALA 1 (AP 1) и CAULIFLOWER (CAL) - гены идентичности цветковых меристем Оба гена кодируют транскрипционные факторы с MADS-доменом Особенности морфологии мутантов ap 1 и cal Arabidopsis thaliana 73

Фенотип двойной мутации ap 1 cal у арабидопсиса У мутанта ap 1 cal меристемы соцветия формируют новые меристемы соцветия, но не цветочные меристемы Соцветие двойного мутанта apetala 1 cauliflower арабидопсиса

Генетический контроль дифференцировки органов цветка ap 3 wt Гомеозисные мутанты арабидопсиса ap 2 ag

ABC-модель развития органов цветка (Coen, Meyerowitz, 1991) Круг 1 2 3 4 Ч B Л A. thaliana A B C AP 1, AP 2 AP 3, PI AG Т П C A Орган Ч Л Т П A. majus SQUA, FIM DEF, GLO PLE Перекрывание доменов экспрессии гомеозисных генов в примордии цветка

Объяснение фенотипов мутантов с нарушением развития органов цветка с помощью АВС-модели 77

Подтверждение АВС-модели путем исследования трансгенных растений AP 3/PI 35 S: : AP 3 35 S: : PI; AP 3/PI ag 35 S: : AP 3 35 S: : PI AP 3/PI AG 35 S: : AP 3 35 S: : PI 35 S: : AG 78

Структура белков, содержащих MADS-домены N C 57 а/к Ceratopteris (CRMl) Antirrhinum (DEFICIENS) Arabidopsis (AGL-15) Consensus (Plants) MCM 1 – регулятор транскрипции дрожжей AG – гомеозисный ген резушки (класс С) DEF –гомеозисный ген львиного зева (класс В) SRF – регулятор транскрипции человека

MADS-гены растений Тип II Meyerowitz, Yanofsky 1990 -1995 Все гены АВС-классов (кроме гена АР 2) имеют структуру MADS-бокс содержащих генов типа II

Экспрессия генов, контролирующих развитие органов цветка ранняя 1, 2, 3 - стадии развития цветка м. РНК AP 2 Регуляция с участием mi. RNA белок AP 2

mi. R 172 регулирует экспрессию гена AP 2 AP 3/PI B Мутация ap 2: C A Ч Л Т A. wt П AG П T B. ap 2 -9 Т П C. 35 S: : MIR 172 a-1 Фенотип трансгенных растений 35 S: : MIR 172 a-1 повторяет фенотипическое проявление мутации ap 2 -9

mi. R 172 регулирует экспрессию гена AP 2

Влияние экспрессии mi. R 172 на локализацию продукта гена AP 2 (a) Область локализации м. РНК AP 2 (на стадии 7 развития цветка (b) Область локализации mi. R 172 (на стадии 7 развития цветка) (c) Домен локализации белка AP 2

Роль генов SEPALLATA в развитии органов цветка wt sep 1 sep 2 sep 3 Pelaz et al. , Nature 2000

Дополненная модель развития цветка SHATTERPROOF 1, 2, SEEDSTICK SEPALLATA 1, 2, 3, 4

Дополненная модель развития цветка «Модель квартета» : продукты генов идентичности органов цветка функционируют в виде гетеротетрамерных белковых комплексов Lohmann et al. , Developmental Cell 2002

Регуляция генов, контролирующих развитие органов цветка Доказано существование прямой регуляции (связывание с ДНК)

Переход апикальной меристемы из недетерминированного состояния в детерминированное Поддержание запаса стволовых клеток в АМ побега Дифференцировка, развитие органов цветка «терминация» цветочной меристемы CLV 3 WUS LFY AG Инициация цветения Lenhard et al. , Cell 2001

AG – подавляет экспрессию гена WUS в меристеме цветка wt ag сохранение экспрессии WUS в меристеме цветка у мутанта ag 90

Кадастровые гены определяют пространственные границы «кругов» : AG C 2 H 2 белки с «цинковыми пальцами» AP 3, PI Фенотип мутации по гену SUPERMAN (SUP) RABBIT EARS (RBE) AG Фенотип мутации по гену RBE 4 3 П 2 1 Л Т Ч AP 3, PI AG Круг 1 2 3 4 B C A Орган Ч Л Т П 91

Наследуемые «эпимутации» : варианты цветка у Linaria vulgaris зигоморфный (дикий тип) актиноморфный (пелорический) Образец пелорического цветка из гербария К. Линнея (1744 г. ) 92 Cubas et al. , 2009

Мутации в генах CYCLOIDEA и DICHOTOMA у Antirrhínum приводят к появлению пелорических цветков дикий тип DICHOTOMA CYCLOIDEA cycloidea dichotoma cycloidea - кодируют ТФ из семейства TCP, определяют скорость инициации и развития примордиев органов цветка Luo et al. , 2005 93

Роль ТФ CYCLOIDEA и DICHOTOMA в формировании симметрии цветка Мишени CYC/DICH - RADIALIS и DIVARICATA – ТФ MYB, регулирующие идентичность дорзального и вентрального домена 94 зигоморфного цветка

У растений с пелорическими цветками Linaria vulgaris показано наследуемое метилирование локуса Lcyc ( «эпимутация» ) Анализ метилирования в локусе Lvcyc у пелорических «мутантов» льнянки с помощью чувствительных к метилированию рестриктаз Sau 3 A и Mbo. I Соматическая нестабильность пелорического фенотипа коррелирует с деметилированием в локусе Lcyc 95 Cubas et al. , 2009

Гиперметилирование локуса SUPERMAN у «эпимутантов» clark kent (clk) дикий тип superman clark kent 96 Jacobsen and Meyerowitz, 1997

Эволюция регуляции развития цветка Theissen and Melzer, 2007 97

«mostly-male» theory Модели, объясняющие формирование в ходе эволюции обоеполого цветка Зависимость экспрессии «мужских» и (C+B) и «женских» (С) генов от градиента продукта гена LFY «out-of-male» theory «out-of-female» theory 98 Ferrandiz et al. Carpel development. From Advances in botanical research, V. 55. 2010

Модель, объясняющая распределение областей экспрессии «мужских» и (класс C+B) и «женских» (класс С) генов в зависимости от градиента продукта гена LFY Theissen and Melzer, 2007 99

Эволюция регуляции развития цветка 100 Chanderbali et al 2010

Мутации в АВС- генах приводят к формированию цветков разной структуры за счет изменения характера экспрессии этих генов (изменения доменов экспрессии в результате изменения уровня экспрессии, нарушения взаимодействий с другими регуляторными белками) Можно предполагать, что именно изменения характера экспрессии консервативных генов ортологов АВС лежат в основе всего разнообразия форм цветка покрытосеменных Цветки с двойным венчиком (лилейные) В Л A Л Т С П В Ч A Ч С Т П Цветки с двойной чашечкой

Формирование цветков однодольных (Лилейные) Модифицированная модель 102

Гены класса В DEF-подобные гены GLO-подобные гены Tulipa gesneriana TGDEFA, TGDEFB Lilium regale TGGLO LRDEF LRGLOA, LRGLOB LMADS 1 ? Tria. DEF Tria. GLO Lilium longiflorum Tricyrtis affinis

Экспрессия генов класса В Tulipa gesneriana Tricyrtis affinis Asparagales: Phalaenopsis equestris, Dendrobium crumenatum, Agapanthus praecox

Tulipa gesneriana дикий тип Мутация viridiflora Double-flowered

Нерешённые вопросы модифицированной АВС модели Muscari armeniacum Asparagus officinalis Tulipa gesneriana

Формирование цветков однодольных (Злаки) 107