Молекулярно-генетические методы в репродуктологии: достижения и

Молекулярно-генетические методы в репродуктологии: достижения и перспективы Кафедра медицинской генетики к. м. н. Елена Евгеньевна Баранова 22 сентября 2015

Более 30% оплодотворенных яйцеклеток у человека имеют анеуплоидии С анеуплоидией До 50% всех выкидышей имеют анеуплоидии Без анеуплоидий С анеуплоидией До 40% новорожденных с МВПР имеют Без анеуплоидий анеуплоидии С анеуплоидией Без анеуплоидий Таким образом, анеуплоидии являются ведущей генетической причиной выкидыша, неразвивающейся беременности и врожденных пороков развития! Nagaoka SI, 2012; Hassold T, 2001; http: //www. medicus. ru/diagnostic/patient/rannee-vyyavlenie-patologij-ploda-33892. phtml

Характеристика фертильности женщины в зависимости от возраста (по Maroulis et al. , 1991) 100 90 80 70 60 Фертильность (в %) 50 40 30 20 10 20 -24 25 -29 30 -34 35 -39 40 -44 Возраст, годы

Частота выявления эмбрионов без анеуплоидий в зависимости от возраста пациентки 50% 45% 40% 35% 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0% до 30 (10) 30 - 35 (30) 35 - 40 (18) после 40 (15) возраст, лет (кол-во пациенток)

Современные уровни детекции анеуплоидий и других ХА в репродуктологии До зачатия Консультирование пар В программах ВРТ Предимплантационный генетический скрининг, диагностика Неинвазивный Во время беременности пренатальный тест Инвазивная диагностика: молекулярное кариотипирование

Клиническое приложение метода высокопроизводительного секвенирования I. Количественные нарушения хромосом (анеуплоидии) и крупные структурные аномалии Предимплантационный Неинвазивная пренатальная генетический скрининг диагностика анеуплоидий на анеуплоидии - PGS (NIPT) II. Секвенирование таргетных генов и генома

Эволюция методов пренатальной диагностики 70 -е 80 -е 90 -00 -е Н. В. Сывороточный скрининг во II скрининг в I NIPT триместре Non-Invasive Prenatal Testing Формирование Материнские (NIPT) группы риска – сывороточные возраст матери маркеры + УЗИ в во II триместре Риск потери плода 1 -2%

NIPT основан на определении свободной плодовой ДНК Поступление внеклеточной Доля плодовой ДНК в среднем 10 -11% Для анализа необходимо ≥ 4 -5% ДНК плода в кровь матери Доля зависит от ряда факторов Повышается при: • увеличении срока беременности • наличия осложнений беременности Снижается при: • повышенной массе тела беременной женщины • онкологических заболеваниях у женщины Для достоверного анализа необходимо уметь определять долю плодовой ДНК NIPT можно использовать у повторно беременных женщин, так как ДНК плода исчезает из кровотока матери в течении суток (период полураспада 2 часа) Gregg, A. R. , et al. , ACMG statement on noninvasive prenatal screening for fetal aneuploidy. Genet Med. 15(5): p. 395 -8 .

Этапы проведения исследования Выделение Забор крови из вены Секвенирование внеклеточной ДНК https: //fertivitro. wordpress. com/2013/05/ Результат Биоинформатический • Надежность – высокая точность определения анализ данных трисомии • Простота – разработанный алгоритм анализа данных • Скорость – получение результата через • Доступность – чем больше поток пациентов, тем дешевле анализ образца

Биоинформатический анализ данных Алгоритм • Получаем несколько миллионов коротких фрагментов • Знаем представленность каждой хромосомы в геноме • Знаем сколько фрагментов приходится на каждую хромосому • При трисомии – лишняя хромосома • Увеличение количества фрагментов • Считаем «статистику»

Биоинформатический анализ данных Визуальное представление

Выявление анеуплоидий при NIPT (обобщенные литературные данные) Частота ложно- выявления положительных результатов Trisomy 21 99. 5% 0. 1% Trisomy 18 92– 100% 0– 0. 3% Trisomy 13 68– 100% 0– 1. 1% Nicolaides KH et al. , AJOG 2012; Ashoor G et al. , UOG 2013; Chiu RW et al. , BMJ 2011; Chen EZ et al. , Plo. S One 2011; Ehrich M et al. , AJOG 2011; Palomaki GE et al. , Genet Med 2011; Palomaki GE et al. , Genet Med 2012; Ashoor G et al. , AJOG 2012; Bianchi D et al. , Obstet Gynecol 2012; Norton ME et al. , AJOG 2012; Sparks AB et al. , AJOG 2012

Неинвазивный пренатальный тест (NIPT) Преимущества Самая высокая чувствительность и специфичность при тестировании на T 21 и T 18 (DR>99% и FPR <1%) Снижение необходимости в инвазивных процедурах Ограничения Cтоимость исследования Невозможность получения результатов в случае низкой доли плодовой ДНК Необходимость подтверждения положительных результатов инвазивными процедурами

Клиническое приложение метода высокопроизводительного секвенирования I. Количественные нарушения хромосом (анеуплоидии) и крупные структурные аномалии Предимплантационный Неинвазивная пренатальная генетический скрининг диагностика анеуплоидий на анеуплоидии - PGS (NIPT) II. Секвенирование таргетных генов и генома

Зачем проводить ПГС? Около 50% морфологически нормальных эмбрионов являются анеуплоидными Joe Leigh Simpson, Preimplantation Genetic Diagnosis International Society ( PGDIS ) 2013

Предимплантационный генетический скрининг на анеуплоидии - PGS Биопсия полярного бластомера трофэктодермы тельца FISH - Чиповая сравнительная Высокопроизводительное диагностика геномная гибридизация секвенирование ?

Этапы проведения исследования (чиповые технологии) Полногеномная Гибридизация на Биопсия эмбриона чипах амплификация Результат Анализ данных Получение «виртуального кариотипа»

Этапы проведения исследования (высокопроизводительное секвенирование) Биопсия эмбриона Полногеномная Секвенирование амплификация Результат Анализ данных Подсчет количества фрагментов для каждой хромосомы

Сравнительная геномная гибридизация на чипах 46, XX Высокопроизводительное секвенирование

Сравнительная геномная гибридизация на чипах chaotic Высокопроизводительное секвенирование

Сравнительная геномная гибридизация на чипах -13 +14, XY Высокопроизводительное секвенирование

Спасибо за внимание! http: //ru. depositphotos. com/36354607/stock-photo-smiling-doctor-or-nurse-pointing. html