Молекулярно-генетические методы: обзор и применение Кафедра медицинской генетики

Молекулярно-генетические методы: обзор и применение Кафедра медицинской генетики к. м. н. Елена Евгеньевна Баранова 22 сентября 2014

• Полимеразная цепная реакция (ПЦР) • Капилярное секвенирование • Микроматричный анализ (микрочипы) • Высокопроизводительное секвенирование

Полимеразная цепная реакция (1983 Кэри Муллис)

Визуализация ПЦР продуктов 1. Форез. Дает ответ есть ли продукт, нельзя определить его количество. 2. Интеркалирующий краситель. Работает в случае неспецифичной реакции. 3. Зонд Taq. Man. Работает только когда амплифицируется целевой продукт

Теория: Практика: Количество копий одной Ct - точка, в которой уровень молекулы после N циклов флуоресценции превысил заданный амплификации 2 N порог 4500 Сp – точка, в которой кривая 4000 3500 3000 флуоресценции имеет максимальный количество копий 2500 2000 наклон 1500 1000 500 0 5 10 номер цикла

Для чего применяется? • Определение наличия/отсутствия какого-то участка ДНК в образце • Определение количества мишени в образце (необходима калибровка) • Определение однонуклеотидных полиморфизмов

Определение однонуклеотидных полиморфизмов «гасилка» зонд праймер1 праймер2 Q F T T/C Исходные данные 1. ПЦР амплификация фрагмента ДНК 2. Плавление d. F/d. T Гомозигота (референс) Гетерозигота Гомозигота (мутация)

Ограничения метода • Искомая последовательность/SNP должны быть известны заранее • 1 система – 1 точка • Полиморфизмы в соседних позициях могут мешать детекции целевого SNP

• Полимеразная цепная реакция (ПЦР) • Капилярное секвенирование • Микроматричный анализ (микрочипы) • Высокопроизводительное секвенирование

«Сэнгеровское» секвенирование (1977 г, Фредерик Сэнгер)

• Полимеразная цепная реакция (ПЦР) • Капилярное секвенирование • Микроматричный анализ (микрочипы) • Высокопроизводительное секвенирование

Принцип метода

Для чего применяется? • Молекулярное кариотипирование • Полногеномный анализ SNP • Анализ транскриптомного профиля

Сравнительная геномная гибридизация

Молекулярное кариотипирование с использованием SNP

Анализ транскриптомного профиля

Ограничения метода Молекулярное кариотипирование: • Нельзя увидеть сбалансированные транслокации SNP • Можно увидеть только описанные SNP Анализ транскриптомного профиля • Детектирует только описанные транскрипты • Все находки необходимо подтверждать альтернативными методами

• Полимеразная цепная реакция (ПЦР) • Капилярное секвенирование • Микроматричный анализ (микрочипы) • Высокопроизводительное секвенирование

Секвенирование синтезом (Illumina) Длина чтения от 50 до 300 пн Время запуска от 1 дня Падает точность к концу чтения Возможно чтение с 2 -х концов

Пиросеквенирование (Roche 454) 1. Фрагментация ДНК 2. Лигирование адаптеров 3. Денатурация + изоляция Длина чтения до 700 одноцепочечной пн. биотинилированной ДНК Время запуска ~ день Проблема – чтение гомополимеров 4. Эмульсионная ПЦР

Полупроводниковое секвенирование Ion Torrent Длина чтения до 500 пн. Время запуска ~ 2 часа Используются немодифицированные нуклеотиды Проблема – чтение гомополимеров

Секвенирование лигированием (SOLi. D) Длина чтения 35 -50 пн. Время запуска ~ 2 недели Высокая точность чтения Проблема короткие риды

Применение метода: Секвенирование отдельных генов/панелей генов Секвенирование экзома Секвенирование полного генома Секвенирование транскриптома Chi. P seq

Секвенирование генов/панелей генов/экзома 1. Обогащение целевыми участками (PCR, гибридизация) 2. Приготовление библиотек/баркодирование образцов 3. Секвенирование 4. Анализ данных Что можно увидеть: • SNP • Короткие инсерции/делеции Проблемы: • Интерпретация результатов для не описанных полиморфизмов • Ошибки секвенирования (зависит от технологии)

Секвенирование полного генома 1. Фрагментация ДНК 2. Приготовление библиотек/баркодирование образцов 3. Секвенирование 4. Анализ данных Что можно увидеть: • SNP • Короткие инсерции/делеции • CNV • Инверсии/транслокации (при использовании парных библиотек) Проблемы: • Интерпретация результатов для не описанных полиморфизмов • Ошибки секвенирования (зависит от технологии)

Секвенирование транскриптома (РНК) 1. Получение к. ДНК 2. Фрагментация к. ДНК 3. Приготовление библиотек/баркодирование образцов 4. Секвенирование 5. Анализ данных Что можно увидеть: • Уровень представленности транскриптов • Ранее не описанные транскрипты Проблемы: • Нормализация данных • Поиск химерных транскриптов

Чиповые технологии Affymetrix Agilent а) Делеции фрагментов генов а) Делеции фрагментов б) Дупликации фрагментов генов хромосом в) Однородительские дисомии (UPD) б) Дупликации фрагментов г) Мозаицизм хромосом

Дизайн исследования 3. Гибридизация 1. Получение образца 2. Пробоподготовка и направления (3 дня) (1 день) Меченые фрагменты ДНК Олигонуклеотидные зонды 4. Сканирование чипов, получение первичных данных и оценка их качества Миллионы специфических зондов 5. Интерпретация результатов и подготовка заключения Итого анализ занимает 3 -7 дней

«Классическая» цитогенетика и «Исследование на микрочипе» Оба метода позволяют оценить весь набор хромосом (кариотип) «Классическая» цитогенетика Молекулярное кариотипирование Реальный кариотип «Виртуальный» кариотип

«Классическая» цитогенетика и «Исследование на микрочипе» Классическая Молекулярное цитогенетика кариотипирование Размер выявляемых изменений Классическое кариотипирование не Практически нет ограничений: может выявить хромосомные возможность детекции вариаций перестройки размером до 5 -10 Mb - числа копий отдельных участков 5 -10 млн п. н. !!! генома (CNV) >20 kb. Диагностическая значимость Возможность диагностики десятков Возможность диагностики СОТЕН генетических заболеваний. Вероятность ошибок Автоматизация Результат сильно зависит от исследования (снижение ошибок в квалификации исследователя. рутинной работе).

Ограничение ДНК-диагностики на микрочипах высокого разрешения 1. Результаты исследования не исключают: 1. сбалансированных хромосомных аберраций 2. точечных мутаций генов (SNP) 3. мелких дупликаций, делеций в участках, находящихся за пределами исследуемой области (неспецифические участки хромосом) 4. низкого уровня мозаицизма (<15%) 2. Высокая цена. ДНК-диагностика на микрочипах высокого разрешения не заменяет «классическую» цитогенетику! Ненахождение патогенных мутаций не отменяет генетическую природу заболевания! Должны быть показания для анализа!

Показание для исследования ДНК-диагностика на микрочипах высокого разрешения Плод Ребенок • пороки у плода • множественные пороки развития в • риск по результатам сочетании с микроаномалиями комбинированного скрининга развития, гипотония ( free-βh. CG/PAPP-A, ТВП, возраст женщины) Высокий риск хромосомной патологии + Нормальный кариотип ДНК-диагностика на микрочипах высокого разрешения для исключения субмикроскопических хромосомных делеций или дупликаций

Возможности ДНК-диагностики на микрочипах высокого разрешения На сегодняшний день ДНК-диагностика на микрочипах высокого разрешения является единственным методом, позволяющим диагностировать все возможные микроделецийные и микродупликационные синдромы в пределах всего генома. www. rarechromo. org

Клинические показания для «Исследования на микрочипе»

Показания для «Исследования на микрочипе» Неонатология и педиатрия Тест - системы, используемые для анализа, рекомендованы как постнатальный генетический тест «первой линии» Пренатальная диагностика При использовании для целей инвазивной пренатальной диагностики только стандартного кариотипирования плодов с аномалиями развития остается нераспознанными до 60% геномных нарушений Любое подозрение на несбалансированность генома или хромосомную нестабильность

Рекомендации по интерпретации результатов хромосомного микроматричного анализа arr[hg 19] 7 p 22. 3(1, 316, 238 -1, 500, 043)x 3 arr[hg 19] 8 q 24. 23(137, 688, 123 -137, 862, 435)x 1

«Частые» трисомии Ребенок П. МВПР СИНДРОМ ЭДВАРДСА arr (18)x 3

«Частые» трисомии Ребенок Ш. МВПР TRIPLO - X arr (X)x 3

Плод с голопрозэнцефалией

Триплоидия 69, XXY

Рекомендации по интерпретации 1. Предварительная оценка Вероятно доброкачественная Неизвестно Патогенная Описаны ли микроделеционные или микродупликационные синдромы? Доброкачественная + Обязательная сверка с собственной базой данных! Вероятно патогенная

Рекомендации по интерпретации 2. Размер Дупликация 14 q 32. 33 (размер 646 kb) arr[hg 19] 14 q 32. 33(106, 044, 262 -106, 872, 853)x 3 Есть у 50% здоровых обследуемых!

Рекомендации по интерпретации 3. Содержит гены? Какие? a) Область, богатая генами / нет, лишена генов, состоит из повторяющихся последовательностей или псевдогенов Дупликация 14 q 32. 33

Рекомендации по интерпретации 3. Содержит гены? Какие? b) Каждый ген должен быть тщательно изучен с помощью базы OMIM и последних публикаций: ü клинические ассоциации üвозможное влияние дозы гена на фенотип: критично увеличение или уменьшение дозы копий

Рекомендации по интерпретации 3. Содержит гены? Какие? Дисбаланс дозы генов, приводящих к аутосомно – рецессивным или аутосомно – доминантным синдромам может: a) Не приводить к заболеванию b) Приводить к заболеванию

Рекомендации по интерпретации 3. Содержит гены? Какие? Дисбаланс дозы генов, приводящих к аутосомно – рецессивным или аутосомно – доминантным синдромам может: http: //synapse. koreamed. org/DOIx. php? i d=10. 3803/jkes. 2005. 20. 1. 96&vmode=P с) Приводить к совершенно другому фенотипу Активирующие мутации в гене FGFR 1 Делеция гена FGFR 1 UBREADER

Пациентка, 34 лет Соматически здорова Брак I не родственный Наследственность не отягощена. Профессиональные вредности у супругов отсутствуют. В анамнезе одна нормально протекавшая беременность, завершившаяся рождением здоровой дочери Женщина направлена на консультацию при второй настоящей беременности, срок 13 -14 недель Результаты УЗИ: ТВП 2, 9 мм, реверсный кровоток в венозном протоке. На основании результатов УЗИ и уровней ß-ХГ и РАРР-А в крови женщины с помощью компьютерного анализа установлен риск трисомии 21 хромосомы 1: 65. Произведен трансабдоминальный хориоцентез по стандартной методике. Кариотип: 46, ХХ

Пациентка, 34 лет В 21 неделю при УЗИ отмечена плацентомегалия, а у плода: ü алобарная голопрозэнцефалия, üмикроцефалия, ü гипотелоризм, üвыраженный гидроторакс, üасцит, üотек мягких тканей головки и туловища, üгипоплазия легких Беременность прерывали.

Дупликация 10 q 26. 11 q 26. 3 (120 678 170 -135 404 523)x 3, Размер 15 Mbp Делеция 13 q 31. 3 q 34 (93 390 362 -115 059 020)x 1, Размер 22 Mbp

Кариотип у отца 46, XY, t (10; 13)(q 26. 1; q 31. 3)

Новорожденный ребенок Направление в связи с: полимикрогирией, кардиомиопатией и специфическим фенотипом: низкопосаженные уши, вдавленная переносица, длинный фильтр, брахимикроцефалия, большой родничок, эпикант. Гипотония. Кариотип 46, XY http: //www. 1 p 36 dsa. org/

Результаты хромосомного микроматричного анализа

Делеция chr 1 p 36 (monosomy 1 p 36 Syndrome) arr[hg 19] 1 p 36. 33 p 36. 31(903, 501 -7, 027, 594)x 1, размер 6105 kb OMIM-аннотированные гены (Online Mendelian Inheritance in Man): NOC 2 L (610770), HES 4 (608060), ISG 15 (147571), AGRN (103320), MIR 200 B (612091), MIR 200 A (612090), MIR 429 (612094), TNFRSF 18 (603905), TNFRSF 4 (600315), SDF 4 (614282), SCNN 1 D (601328), CPSF 3 L (611354), TAS 1 R 3 (605865), DVL 1 (601365), AURKAIP 1 (609183), CCNL 2 (613482), MRPL 20 (611833), VWA 1 (611901), ATAD 3 B (612317), ATAD 3 A (612316), MIB 2 (611141), MMP 23 B (603321), CDK 11 B (176873), MMP 23 A (603320), CDK 11 A (116951), NADK (611616), GNB 1 (139380), CALML 6 (610171), GABRD (137163), PRKCZ (176982), SKI (164780), PEX 10 (602859), PLCH 2 (612836), PANK 4 (606162), HES 5 (607348), TNFRSF 14 (602746), ACTRT 2 (608535), PRDM 16 (605557), MEGF 6 (604266), TPRG 1 L (611460), WRAP 73 (606040), TP 73 (601990), DFFB (601883), AJAP 1 (610972), NPHP 4 (607215), KCNAB 2 (601142), CHD 5 (610771), RPL 22 (180474), ICMT (605851), HES 3 (609971), GPR 153 (614269), ACOT 7 (602587), HES 2 (609970), ESPN (606351), TNFRSF 25 (603366), PLEKHG 5 (611101), TAS 1 R 1 (606225), ZBTB 48 (165270), THAP 3 (612532), DNAJC 11 (614827), CAMTA 1 (611501). The smallest region of overlap was 174 kb and encompassed 5 genes, 1 of which may be involved in signaling in neurons (GNB 1; 139380).

Делеция chr 1 p 36 (monosomy 1 p 36 Syndrome) Признаки: üТяжелая умственная отсталость üОтсутствие речи/ незначительный словарный запас üЗадержка роста üФенотипические особенности Частота: 1: 5 000 -10 000 новорожденных!

Делеция chr 1 p 36 (monosomy 1 p 36 Syndrome) Диагностика:

Спасибо за внимание! http: //www. detskydoctor. ru/doc/medicina/kto-takie-detskie-genetiki/