Молекулярно-генетические методы диагностики Общие методы l Выделение

Молекулярно-генетические методы диагностики

Общие методы l Выделение ДНК l Полимеразная цепная реакция l Рестрикционный анализ l Электрофорез в полиакриламидном и агарозном геле l Блотинг по Саузерну

Оборудование для ДНКдиагностики l Амплификаторы l Термостаты настольные для пробирок (от 25 -95 С) l Центрифуга для микропробирок l Трансилюминатор

Выделение ДНК l Образец- любые ядросодержащие клетки l Фенол-хлороформный метод экстракции ДНК l Выделение с использованием ионобменных смол

Источники геномной ДНК Цельная кровь l Культура клеток l Букальный эпителий l Пятна высушенной крови Другие источники l Сыворотка, плазма крови, образцы мочи, образцы тканей При делециях мт. ДНК предпочтительный материал – образец мышечной ткани l

Электрофорезная камера Буфер Фрагменты ДНК Агарозный гель Чем меньше фрагменты ДНК, тем быстрее они передвигаются в геле

Электрофорез

ПЦР l Состав реакционной смеси: Образец Буфер, содержащий ионы магния Смесь д. НТФ Taq-полимераза Специфические олигонуклеотидные праймеры

ПЦР l Стадии ПЦР Денатурация Отжиг Элонгация

ПЦР полимеразная цепная реакция

Специфичность ПЦР

ДНК-диагностика l Подтверждение диагноза l Диагностика носительства l Пресимптоматическая диагностика l Пренатальная (дородовая) диагностика l Предимплантационная диагностика

Прямая ДНК-диагностика Определение мутации, являющейся непосредственной причиной заболевания Косвенная ДНК-диагностика Определение хромосомы, несущей поврежденный ген при семейном анализе

ДНК-ДИАГНОСТИКА l Возможна только когда известна структура гена l Возможна и без больного члена семьи ( анализ ДНК родителей пробанда) l Высокая точность l Возможна при полилокусном заболевании l КОСВЕННАЯ ДНК-ДИАГНОСТИ КА ПРЯМАЯ ДНКДИАГНОСТИКА Возможна когда известно положение гена, а мутация или последовательность неизвестны l обязательно проведение семейного анализа и анализ образца больного члена семьи l Точность зависит от расположения маркеров l Обязательно наличие одного локуса заболевания l

Прямая ДНК-диагностика l l l ПЦР ( мультиплексная ПЦР, аллельспецифическая амплификация, ПДАФ) ПЦР-ПДРФ анализ ( анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов) Секвенирование (определение последовательности) гена Блотинг по Саузерну Биочипы

ПДАФ Полиморфизм длины амплифицированных фрагментов Примеры : регистрация небольших делеций и дупликаций ДНК-диагностика частой мутации ΔF 508 при муковисцидозе ДНК-диагностика заболеваний, связанных с экспрессией тринуклеотидных повторов l

Аллель-специфичная ПЦР l Один из праймеров коплементарен мутантному аллелю, другойнормальному. Обратный праймер – общий для двух реакций N M N M 1 2 3

Эндонуклеазы рестрикции l Ферменты, узнающие определенные короткие (4 -8 пн) последовательности в ДНК (сайты) и разрезающие двухцепочечную ДНК - Пример: Msp. I (CCGG) GCTGATCCGGGGCATGGTTCCGGAT

ПДРФ анализ Msp. I узнает последовательность ’CCGG, соответствующую нормальному аллелю --------CCGG-------норма --------CCGA-------мутация Msp. I 100 пн 300 пн 400 пн 300 пн 100 пн режет не режет

Пример: КЛАССИЧЕСКАЯ ГАЛАКТОЗЕМИЯ 5’ экзоны: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Характеристика гена GALT - локализация гена 9 p 13 11 экзонов Характеристика мутации - Описано более 160 различных мутаций Мутации Q 188 R, K 285 N обуславливают тяжелый фенотип (самые частые мутации 70 -80% аллелей) N 314 D обуславливает, т. н. вариант Дуарте S 135 L обуславливает легкий фенотип (62 % аллелей, Африка)

ДЕТЕКЦИЯ МУТАЦИИ Q 188 R (исчезновение сайта рестрикции) 1. ПЦР экзонов 5 -6 гена GALT – фрагмент размером 477 п. н. 377 п. н. 2. Рестрикционный анализ с использованием фермента рестрикции Bst 2 UI (CC^WGG) 270 п. н. 3. При мутации Q 188 R исчезает сайт рестрикции для Bst 2 U I и появляется фрагмент размером 377 п. н. 4. На рисунке справа: 1 – Q 188 R в гетерозиготном состоянии 2 – норма 3 - Q 188 R в гомозиготном состоянии 107 п. н. 100 п. н. 1 2 3

ДЕТЕКЦИЯ МУТАЦИИ К 285 N (появление сайта рестрикции) 1. ПЦР экзона 9 гена GALT – фрагмент размером 160 п. н. 2. Рестрикционный анализ с использованием фермента рестрикции Sse 9 I (^AATT) 3. При мутации K 285 N возникает сайт рестрикции для Sse 9 I и появляются фрагменты размером 98 п. н. И 62 п. н. 4. На рисунке справа: 1– Норма 2 – K 285 N в гетерозиготном состоянии 160 п. н. 98 п. н. 62 п. н.

Мультиплексная ПЦР l ПЦР с несколькими парами праймеров, соответствующих разным участкам гена Пример –ДНК-диагностика делеций при миодистрофии Дюшена

Методы поиска мутаций в генах l. SSCP-анализ l. Денатурирующий гель электрофорез или денатурирующая ВЭЖХ l Секвенирование l. Биочипы l. Блотинг по Саузерну (детекция крупных перестроек)

SSCP-анализ l Анализ конформационного полиморфизма однонитевой ДНК l Замена даже одного нуклеотида приводит к измененим конформации цепей, что изменяет их электрофоретическую подвижность l Чувствительность 70 -80%

Гибридизация l Комплементарное взаимодействие между одноцепочечными полинуклеотидами из разных источников меченная ДНК –проба, зонд связывается с комплементарной ей последовательностью

Блотинг l 1. 2. 3. 4. 5. Саузерн-блотинг Рестрикция Разделение изучаемого фрагмента в геле Денатурация Перенос на мембрану Гибридизация с меченной пробой

Делеции мт. ДНК N Del 8000 пн Del 12 000 пн 16500 пн 8500 пн 4500 пн

Биочипы l Матрица на которую нанесены тысячи олигонуклеотидов Олигонуклеотиды специфично гибридизуются с меченными молекулами ДНК

Секвенирование ДНК

Косвенная ДНК-диагностика l Основана на анализе сцепления l Анализ полиморфных маркеров ДНК 1 1 2 4 3 2 3 4 1 3

Вариабельность ДНК l Около 99, 7% ДНК-последовательности у всех людей идентичны l Около 0, 3% (примерно 10 000 нуклеотидов) различаются между отдельными индивидами.

Полиморфные варианты ДНК l Различия в последовательности ДНК (Однонуклеотидные полиморфизмы – SNP) ------AGGCTG------------AAGCTG------l Различия в длине последовательностей -----AATG-------------AATG-------

Повторяющиеся последовательности Сателлитная ДНК – размер повторяющегося элемента от нескольких сотен до нескольких тысяч пн l Минисательтная ДНК (VNTR – variant number tandem repeats) размер повторяющегося элемента 10 -100 пн l Микросательтная ДНК (STR – short tandem repeats) размер повторяющегося элемента 2 -6 пн l

Номенклатура ДНКмаркеров l ДНК-маркеры, расположенные за пределами гена обозначаются согласно их положению на хромосоме. D 16 S 539 D – ДНК 16 - хромосома S – единичная копия последовательности 539 - 539 локус описанный на хромосоме 16

Выбор ДНК-маркеров l Внутригенные ДНК-маркеры (полиморфизмы в генах ) l Расположенные близко к исследуемому гену. Фланкирующие ген с теломерной и центромерной сторон

l. Чем ближе расположены маркеры к гену, те чем теснее они сцеплены, тем ниже процент ошибки A 4 A 3 М A 2 Н A 1 l. Расстояние A 4 М A 2 A 3 Н A 1 A 3 A 4 М A 2 Н A 1 оценивают в сантиморганидах (1 СМ – 1%- 1000 пн)

?

Пример ? 99 пн 96 пн 105 пн 90 пн

ДНК-диагностика § по возможности использовать несколько подходов к диагностике (например, прямые и косвенные) § анализ семейного материала даже в случае прямой диагностики § Контроль воспроизводимости результатов § Контроль на загрязнение плодного материала материнским

Номенклатура ДНКмаркеров l Если маркер находится внутри гена, то для обозначения используют сокращенное наименование гена HUMTH 01 HUM- Геном человека TH-Ген тирозин гидроксилазы 01 –интрон 1 данного гена