Молекулярно-биологические методы диагностики инфекционных болезней птиц Старший научный

Молекулярно-биологические методы диагностики инфекционных болезней птиц Старший научный сотрудник диагностического центра ГНУ ВНИВИП Абгарян Сусанна Рафиковна

Что определяет строение организма

ДНК-Структура 1953 Ф. Крик (Англия- 1916 -2004) Дж. Уотсон (США р. 1928) Лаборатория молекулярной биологии, Кембридж, Великобритания. ДНК – имеет структуру двойной спирали. Показана ее биологическую роль. Нобелевская премия 1962

ДНК- структура Согласно предложенной модели Уотсона и Крика, ДНК построена в виде двойной спирали, состоящей из двух полинуклеотидных цепей, сплетенных друг с другом так, что на каждый виток спирали приходится 10 пар оснований. Основания - аденин, тимин (в РНК урацил), гуанин, цитозин - расположены вдоль оси спирали, а сахарофосфатные цепи - по периферии и направлены антипараллельно другу. Различия в последовательности, составленной из четырех нуклеотидов, в молекулах ДНК лежат в основе генетического разнообразия.

Строение нуклеотидов Азотистое основание – 4 вида: адeнин (А) гуанин (G) тимин (Т) или урацил (U) цитозин (С) Пятиуглеродный сахар – 2 вида: рибоза (РНК) 2 -дезоксирибоза (ДНК) Остаток фосфорной кислоты, придает НК свойства кислоты

Первичная структура НК - последовательность нуклеотидов фосфатная группа одного нуклеотида присоединяется к сахару другого, и так далее – образуется сахаро-фосфатный остов молекулы НК. 5’-A-C-G-T-A-A-G-G-T-C-A-A-T-G-3’

Вторичная структура НК образуется за счет взаимодействий нуклеотидов между собой (образование водородных связей). Двойная спираль ДНК - комплекс двух антипараллельных цепей ДНК, закрученных относительно общей оси Принцип комплементарности - каждому азотистому основанию одной цепи соответствует строго определенное основание другой цепи: напротив A стоит T, а напротив G располагается C. Таким образом, последовательность нуклеотидов в одной цепи молекулы ДНК однозначно предопределяет нуклеотидную последовательность другой цепи.

Принцип комплементарности

Достоинства ПЦР n n n Высокая чувствительность Высокая специфичность Проста в исполнении Нет необходимости в сложной очистке ДНК или РНК перед анализом Возможность работы с практически любым биологическим материалом

n n n n Спектр услуг по диагностике заболеваний птиц Вид исследования Геморрагический энтерит индеек Гепатит Е Инфекционный Энцефаломиелит птиц Грипп птиц Инфекционный бронхит кур Орнитобактериоз Вирусный гепатит уток Метапневмовирус В том числе Серотип А Серотип В Серотип С

Спектр услуг по диагностике заболеваний птиц • Инфекционная бурсальная болезнь • Инфекционная анемия цыплят • Реовирусный теносиновит • Чума уток • Инфекционный ларенготрахеит • М. Gallisepticum • M. synoviae • Болезнь Ньюкасла • Оспа птиц • Парвовирусный энтерит гусей • Полиомавирусная инфекция гусей

Виды биологического материала, используемого для ПЦР-диагностики n n n n n Цельная кровь (сыворотка, плазма) Экстраэмбриональная жидкость Моча, сперма, носовая, влагалищная, препуциальная слизь Фекалии Слюна, смывы с конъюнктивы, из носовой полости, с прямой кишки Молоко Патологический материал Продукты питания, корма Объекты внешней среды Бактериальные и клеточные культуры, смывы с питательных сред

Этапы проведения ПЦР-анализа Патолог. матер. (ЭЭЖ), смывы Выделение ДНК Амплификация с праймерами Продукт ПЦР Электрофорез в агарозном геле секвениро вание (штаммова я дифферен циация Детекция

ЭТАП ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК и РНК n Цель выделения НК – концентрирование НК в малом объёме (100 мкл), удаление ингибиторов ПЦР и получение очищенного препарата НК

Сорбционный метод выделения ДНК (РНК) Лизис биологического материала Элюция ТЕбуфером РНК/ДНК Сорбция НК на частицы силикагеля (Si. O 2) Подсушивани е при 60 -65 о. С Отмывка от воды ацетоном (для РНК). Отмывка от белков и полисахаридов Отмывка от солей

Этап амплификации Праймеры основа специфичности ПЦР

Этап амплификации Денатурация ДНК (95 о. С) Отжиг праймеров (55 -65 о. С) Полимеризация цепей ДНК (72 о. С)

Процесс амплификации

Разновидности ПЦР n n Классическая ПЦР с детекцией в агарозном геле с добавлением бромистого этидия Real-time PCR

Детекция n Принцип электрофореза основан на движении отрицательно заряженных фрагментов ДНК различного размера, окрашенных бромистым этидием, с разной скоростью под действием электрического поля

Real-time PCR

ПЦР для РНК-геномных возбудителей Выделение РНК Обратная транскрипция к. ДНК Амплификац ия Детекция

Секвенирование ДНК n Проводим штаммовую диффенциацию вирусных болезней используя метод Секвенирования

Секвенирование ДНК -Это определение порядка нуклеотидов в молекуле ДНК (чтение генетического текста)

СЕКВЕНИРОВАНИЕ n n Секвенирование ДНК - определение ее первичной нуклеотидной последовательности (от англ. sequence - последовательность). В результате получается линейный набор нуклеотидов, который отражает индивидуальную структуру молекулы. В настоящее время для секвенирования нуклеиновых кислот обычно применяется метод Сэнгера с дидезоксинуклеозидтрифосфатами (dd. NТР). Обычно до начала секвенирования производят амплификацию участка ДНК, последовательность которого требуется определить, при помощи ПЦР.

Автоматическое секвенирование по Сенгеру

Это определение порядка нуклеотидов в молекуле ДНК (чтение генетического текста) AAGTGACATGGCCTCAGCCTTAATAATTATAACAACATACTCCAAAGTACGTTAATGTTG CAGTATAATATGGCACGAGTAGCCANGTTTTATAACTAATGTGACTGATTCTAGCT

Нуклеотидная последовательность 4/91 Gttataactc gacacaattataataat attacttt Мass Gtgttaactc aatataattataacaaccattacttt 4/91 tgtgttga t tataatatggcaga Мass tgtgttga g tataataatatggcaga

Спасибо за внимание!