Молекулярная нейробиология Регуляция экспрессии генов в центральной нервной

Молекулярная нейробиология Регуляция экспрессии генов в центральной нервной системе Лекция 6 И. А. Гривенников Институт молекулярной генетики РАН

В нервной системе экспрессируется наибольшее количество генов по сравнению с другими тканями организма по разным оценкам у человека от 20 до 40 тысяч генов, кодирующих различные белки (international human genome Sequencing consotrium) Альтернативный сплайсинг, редактирование м. РНК приводит к появлению еще большего разнообразия белковых продуктов Именно это обеспечивает фенотипическое разнообразие клеток нервной системы и разнообразие их функциональной активности

редактирование м. РНК – ферментативная реакция, которая протекает под действием ферментов Аденозиндезаминаза превращает аденин в инозин, который в кодоне узнается как гуанин На примере рецептора для глутамата была продемонстрирована такая замена, которая приводила к замене глутамина в ТМ 2 сегменте рецептора на аргинин. Что в свою очередь приводило к снижению кальциевой проводимости этим каналом (Seeburg, 1998)

Уровни передачи и реализации информации в нервной системе, приводящие к разнообразным фенотипическим проявлениям Лиганды Рецепторы Метаболические пути- пути передачи информации (вторичные мессенджеры, протеинкиназы) Гены раннего ответа (транскрипционные факторы) Гены позднего ответа (определение фенотипа клетки)

Иерархия регуляции экспрессии генов в эукариотических клетках Структура хроматина Регуляция структуры ДНК(метилирование) Инициация транскрипции Элонгация и полиаденилирование Пре-м. РНК сплайсинг и ее транспорт Регуляция транскрипции (транскрипционные факторы) Регуляция элонгации и полиаденилирования Альтернативный сплайсинг Трансляция м. РНК Процессинг (созревание) белка Транспорт белковых молекул и их функционирование Регуляция трансляции Регуляция сборки белка и его процессинга Пост-трансляционная модификация белков

Явление РНК- интерференции в клетке si. RNA, mi. RNA – малые некодирующие РНК регулируют экспрессию генов в организме

Экспрессия генов в качестве усилителя биологического сигнала Ген 1000 х «усиление» транскрипция м. РНК трансляция 100 х «усиление» Белок

Общее строение промоторной части гена.

Транскрипционные факторы (ТФ) регулируют транскрипцию различных генов через связывание с соответствующими регуляторными последовательностями в ДНК Энхансер – усиление экспрессии гена Сайленсер – подавление экспрессии гена

Транскрипционные факторы связываются с cis-регуляторными последовательностями в молекуле ДНК регуляторные последовательности- 6 -20 п. н. Локализация: -Перед геном -Внутри интрона (иммуноглобулин G) -После гена (ген бета-глобина)

Транскрипционные факторы- регулируют транскрипцию различных генов - Конститутивно экспрессирующиеся ТФ (CREB) - Индуцибельные ТФ (c-fos, c-jun и др. )

Основные модели действия транскрипционных факторов.

Транскрипционный фактор CREB (конститутивно экспрессирующийся ТФ) CREB – cyclic AMP response element binding protein (с. АМР отвечающий элемент связывающийся белок) CRE – cyclic AMP response element (с. АМР отвечающий элемент)- последовательность ДНК

Попытки исследовать механизм c. AMP-зависимой регуляции транскрипции привели к обнаружению в 1986 году в промоторе гена соматостатина последовательности из восьми пар нуклеотидов (5 -TGACGTCA-3), ответственной за активацию экспрессии этого гена в ответ на увеличение внутриклеточной концентрации c. AMP

В 1987 году в ядерных экстрактах клеток феохромоцитомы крысы линии PC 12 с помощью CRE-афинной хроматографии был обнаружен фосфопротеин массой 43 к. Да, связывающийся с CRE последовательностью и названный CREB

Транскрипционный фактор CREB (конститутивно экспрессирующийся ТФ) CRE – 5’-TGACGTCA-3’ CREB – м. м. около 43 к. Д Связывается с ДНК в виде димера Активация транскрипции связана с фосфорилированием ser-133 CREB – cyclic AMP response element binding protein (с. АМР отвечающий элемент связывающийся белок) CRE – cyclic AMP response element (с. АМР отвечающий элемент)

Иммуноцитохимическая детекция CREB в гиппокампе

Доменная организация генов CREB- семейства KID - (kinase-inducible domain) домен, содержащий участки фосфорилирования b. ZIP – домен, ответственный за димеризацию Q – домены, ответственные за активацию транскрипции ATF – факторы, активирующие транскрипцию.

Механизм активации транскрипции CREB CBP (CREB-binding protein) и его гомолог P 300 Фосфорилирование по Ser-142 и Ser-143 приводит к разрыву связи p. CREB с CBP

Регуляция CREB и CREB-зависимых генов. icer – индуцируемый CRE репрессор

Активация транскрипции генов, регулируемых с. АМР.

Разные пути передачи информации в клетке приводят k фосфорилированию и активации CREB

Q-стимуляция транскрипции D- ДНК-связывающий домен Z- лейциновая молния Механизм регуляции CREB- зависимых генов.

Примеры генов в ЦНС, экспрессия которых регулируется транскрипционным фактором CREB (более 100 генов) Neurotransmission/Peptides: Acetylcholinesterase (Ach. E), α 1 -GABAA receptor, β 1 -adrenergic receptor, β 2 -adrenergic receptor, Cardiotrophin-1 (CT-1), Calcitonin gene-related peptide (CGRP), Cholecystokinin (CCK), Chromogranin A, Chromogranin B, Corticotropin-releasing hormone, Dopamine βhydroxylase (DβH), Enkephalin, Galanin receptor 1 (Gal. R 1), Glycoprotein hormone α subunit, Gonadotropinreleasing hormone receptor (Gn. RHR), Human chorionic gonadotropin-α (h. CG-α), Murine gastrinreleasing peptide receptor (m. GRP-R), Neurotensin/neuromedin N (NT/N), Norepinephrine transporter (NET), Pituitary adenylyl cyclase activating polypeptide (PACAP), Preprotachykinin A, Prodynorphin, Proenkephalin, Proglucagon, Secretogranin II, Somatostatin receptor (ssr-2), Substance P receptor, Synapsin I, Tyrosine aminotransferase, Vasoactive intestinal polypeptide (VIP), Vasopressin (AVP), Vesicular monoamine transporter (VMAT) Growth Factors/Hormones: BDNF, Fibroblast growth factor-6 (FGF-6), Flt-1, Insulin-like growth factor I (IGF-I), Inhibin α, Leptin, NGF, Vascular endothelial cell growth factor (VEGF), Transforming growth factor-β 2 (TGF-β 2), Trk. B Structural: E-cadherin, Fibronectin, ICAM-1, Neurofilament 68 k. Da (NF-L)

Примеры генов в ЦНС, экспрессия которых регулируется транскрипционным фактором CREB (более 100 генов) Channels/Transporters: Aquaporin-2 (AQP-2), Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), Glucose transporter 2 (GLUT 2), Kv 3. 1 K+-channel, Na+/K+-ATPase α Cellular Metabolism: Arylalkylamine N-acetyltransferase (AA-NAT), Bcl-2, Cyclooxygenase-2 (COX-2), Cytochrome c, Glutamine synthetase (GS), Heme oxygenase-1 (HO-1), Hexokinase 2, HMG -Co. A synthase, Neuron specific enolase (NSE), Ornithine decarboxylase, Phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK), Pyruvate carboxylase, Superoxide dismutase 2 (SOD 2), Ubiquitin-conjugating enzyme, Uncoupling protein-1 (UCP 1), Uncoupling protein-2 (UCP 2), Uncoupling protein-3 (UCP 3) Transcription: Activating transcription factor-3 (ATF-3), C/EBP-β, c-fos, CREB, Egr-1, ICER, Jun. D, Krox-20, m. Per 1, m. Per 2, Nurr 1, Pit-1, STAT 3 Signal Transduction: 14 -3 -3 -epsilon, Cyclin A, Cyclin D 1, Inducible nitric oxide synthase (i. NOS), Neurofibromatosis 1 (NF-1), Neuronal nitric oxide synthase (n. NOS), Prostaglandin synthase-2 (PGS 2), Serum and glucocorticoid inducible kinase

Транскрипционные факторы c-fos, c-jun (индуцибельные транскрипционные факторы, АР-1) относятся к генам быстрого ответа и образуют димеры. v-fos из вируса остеосаркомы мышей v-jun из вируса саркомы птиц 5’- TGACTCA-3’ TRE (TPA – response element) ( элемент отвечающий на действие форболовых эфиров)

Клеточные транскрипционные факторы c-fos, c-jun являются гомологами вирусных генов v-fos и v-jun, которые являются классическими онкогенами. Соответственно их клеточные гомологи получили название – протоонкогены.

Представители Fos семейства: c-Fos, Fra-1, Fra-2, Fos. B Представители Jun семейства: c-Jun, Jun. B, Jun. D Активация транскрипции наиболее эффективна при образовании гетеродимеров c-Fos, c-Jun. Гомодимеры c-Fos практически не активируют транскрипцию, тогда как гомодимеры c-Jun способны слабо активировать транскрипцию

Активация экспрессии c-Fos, c-Jun протекает под действием Различных нейротрансмиттеров и факторов роста (например: фактор роста нервов или нейротрофический фактор из мозга) Ген c-Fos содержит ( в регуляторной части) 3 участка связывания для СREB Фосфорилирование c-Fos, c-Jun различными киназами влияет как на их связывание с ДНК так и на способность стимулировать транскрипцию генов

Лейциновая молния (застежка) в транскрипционных факторах, необходимая для их димеризации Характерна для суперсемейства белков (b. ZIP)

Стероидные гормоны и активация транскрипции Минералокортикоиды и Глюкокортикоиды синтезируются в коре надпочечников Минералокортикоиды (альдостерон) – регуляция солевого обмена (транспорт ионов натрия) Глюкокортикоиды (кортизол) – ответ на стресс, влияние на метаболизм, иммуносупрессия и воспаление (у мышей и крыс в основном присутствует кортикостерон)

Структура некоторых стероидных гормонов

Immunohistochemical localization of type I corticosteroid receptor (mineralocorticoid receptor) in the rat hippocampus. A: Mineralocorticoid immunoreactivity is concentrated in pyramidal cell fields of the CA 2 region. B: High-power photomicrograph shows that steroid-bound mineralocorticoid receptors are primarily localized to neuronal cell nuclei Описано 2 типа кортикостериидных рецепторов (тип-I-минералокортикоиды, тип- II глюкокортикоиды) в мозге, которые отличаются по связывающим свойствам, аминокислотной последовательности, локализации и функциям. Рецепторы могут быть локализованы как на разных нейронах так и на одном.

Структура рецепторов и последовательности ДНК для их связывания

Активация глюкокортикоидных рецепторов В цитоплазме рецепторы находятся в комплексе с HSP 70 и HSP 90

«цинковые пальцы» - структура транскрипционных факторов, необходимых для связывания с ДНК Структура Cys-X 2 -Cys-X 13 -Cys-X 2 -Cys

Регуляция транскрипции генов цитокинами

SOCS – супрессор сигнала от цитокинов STAT - передатчик сигнала активатор транскрипции

Гомеобокс-содержащие факторы транскрипции Основные работы выполнены на плодовой мушке Дрозофилле Гомеобокс – консервативный домен, состоящий примерно из 60 а. о. Важные транскрипционные факторы необходимые для правильного развития организма. (Antp, bithorax локусы)

В клетках млекопитающих были открыты сходные транскрипционные факторы, которые определяли специфическую транскрипцию определенных генов в определенных типах клеток. Семейство POU белков: Pit 1/GHF-1, Oct-1, -2, unc-86

Структура HLH транскрипционных факторов

Таким образом, - существует большое количество факторов регулирующих транскрипцию определенных генов нервной системе, - существует большое разнообразие в строении различных транскрипционных факторов В клетке примерно каждый десятый- двадцатый ген кодирует тот или иной транскрипционный фактор