Молекулярная нейробиология Лекция 11 Дифференцировка нервных и глиальных

Молекулярная нейробиология Лекция 11. Дифференцировка нервных и глиальных клеток в ЦНС. Стволовые клетки. Эмбриональные стволовые клетки И. А. Гривенников Институт молекулярной генетики РАН

Образование нервных и глиальных клеток в организме, а также образование многочисленных точных и функционально активных контактов между ними протекает под контролем генетического аппарата и факторов внешней среды.

Центральная нервная система – головной и спинной мозг Периферическая нервная система – черепно- и спинно- мозговые нервы, периферические ганглии Периферическая нервная система обеспечивает взаимодействие ЦНС с органами и тканями всего организма. Включает в себя вегетативную и соматическую нервную систему Вегетативная нервная система в свою очередь включает симпатическую и парасимпатическую нервные системы

Симпатическая и парасимпатическая нервная система Свойства Симпатическая Парасимпатическая Происхождение нервных волокон Выходят из черепного, грудного и поясничного отделов ЦНС. Выходят из черепного и крестцового отделов ЦНС. Расположение ганглиев Рядом со спинным мозгом. Рядом с эффектором. Длина волокон Короткие преганглионарные и длинные постганглионарные волокна. Длинные преганглионарные и короткие постганглионарные волокна. Число волокон Многочисленные постганглионарные волокна Немногочисленные постганглионарные волокна Распределение волокон Преганглионарные волокна иннервируют обширные области Преганглионарные волокна иннервируют ограниченные участки Зона влияния Действие генерализованное Действие местное Медиатор Норадреналин Ацетилхолин Общие эффекты Повышает интенсивность обмена Снижает интенсивность обмена или не влияет на нее -"- Усиливает ритмические формы активности Снижает ритмические формы активности -"- Снижает пороги чувствительности Восстанавливает пороги чувствительности до нормального уровня Суммарный эффект Возбуждающий Тормозящий В каких условиях активируется Доминирует во время опасности, стресса и активности Доминирует в покое, контролирует обычные физиологические функции

Важнейшую роль в правильном последовательном развитии нервной системы млекопитающих и различных ее отделов играют Транскрипционные факторы

Развитие ЦНС Зигота Морула Бластула (эмбриональные стволовые клетки) Гаструла (закладка трех зародышевых листков)

Нервная пластинка (производное эктодермы) в дальнейшем происходит образование нервного желобка, а из него нервного гребня и нервной трубки Из нервной трубки образуется головной и спинной мозг Из клеток нервного гребня образуются клетки периферической нервной системы, пигментные клетки, часть мозговых оболочек, хромаффинные клетки надпочечников, хрящи черепа

Развитие ЦНС I II СГК III ВЯС IVA IVB НЯС IVC V VI СГК – слой ганглиозных клеток ВЯС – внутренний ядерный слой НЯС – наружный ядерный слой G 1 S G 2 M

Ядерные транскрипционные факторы, участвующие в развитии неокортекса и сетчатки Неокортекс мозга: Сетчатка глаза: Pax 6 Prox 1 SIX 3 Sox 2 Dlx 2 Emx 1 Nkx 2. 1 и др Pax 6 Prox 1 SIX 3 Sox 2 RX 1 Otx 2 Lhx 2 SIX 6 и др. В ЦНС человека до 8 недели развития присутствует экспрессия Oct 4 и Nanog (Thomas S. et al. , 2008)

Иммуногистохимический анализ и ОТ-ПЦР неокортекса и сетчатки эмбриона человека на 9 -10 неделе развития НЕОКОРТЕКС СЕТЧАТКА nes Ki 67 ВНС СВЗ Pax 6 Prox 1 Pax 6 ННС ВЗ Oct 4 30 мкм nes Oct 4 60 мкм Nanog Vim Nanog ВНС СВЗ GFAP RPL 19 Vim βIII-tub Rec Prox 1 ННС ВЗ Rec RPL 19 βIII-tub 30 мкм βIII-tub 60 мкм М. Александрова, Б. Вердиев, 2010

Иммуногистохимический анализ и ОТ-ПЦР неокортекса плода человека на 20 неделе развития GFAP nes GFAP Pax 6 Prox 1 СВЗ Oct 4 Neu. N КП Nanog ВЗ RPL 19 30 мкм N-cad 30 мкм ПЗ βIII-tub СВЗ 100 мкм ВЗ ВЗ 100 мкм 60 мкм ВЗ М. Александрова, Б. Вердиев, 2010

Иммуногистохимический анализ и ОТ-ПЦР сетчатки плода человека на 20 неделе развития Hoechst Pax 6 Prox 1 СГК Oct 4 ВЯС Nanog nes rec Vim βIII-tub GFAP 60 мкм TH Hoechst Neu. N 60 мкм НЯС NF nes СНВ Rec RPL 19 СГК ВЯС 60 мкм GFAP М. Александрова, Б. Вердиев, 2010 60 мкм НЯС

Формирование нервных и глиальных клеток как в ЦНС так и в ПНС протекает из клеток-предшественников или стволовых клеток

Формирование клеток ПНС из клеток нервного гребня

Факторы роста принимающие участие в дифференцировке клеток нервного гребня Разные ростовые факторы сдвигают дифференцировку в разные типы клеток

Формирование клеток Шванна из клеток нервного гребня

Стадии дифференцировки и образования астроцитов и олигодендроцитов

Факторы регулирующие дифференцировку олигодендроцитов

Эмбриональные стволовые ( ЭС ) клетки ЭС клетки получают из внутренней клеточной массы бластоцисты Основные свойства ЭС клеток: -Способность неограниченно расти в культуре - Способность дифференцироваться в любые типы клеток организма (плюрипотентность) ЭС клетки мыши (Evans, 1981; Martin, 1981) ЭС клетки человека (Thomson, 1998)

Клетки различных тканей, включая нервную, происходят из эмбриональных стволовых клеток Эмбриональные стволовые клетки мыши на фидерном слое фибробластов. а). Кластеры эмбриональных стволовых клеток. б). Фидерный слой фибробластов.

Образование эмбриоидных тел из ЭС клеток Эмбриоидные тела в культуре. а). Эмбриоидные тела. б). Начало миграции клеток из эмбриоидного тела и их дифференцировки.

ЭС клетки и их дифференцировка Дифференцировка in vitro повторяет стадии дифференцировки in vivo

Эмбриоидные тела после обработки ретиноевой кислотой (1 мк. М) Иммунофлуоресцентая детекция антителами к βIII-тубулину (х200)

Пути использования эмбриональных стволовых клеток

Работы по генетическим модификациям ЭС клеток и целенаправленному изменению структуры генов живых организмов получили международное признание. Наиболее значительный вклад в развитие этого научного направления внесли M. Капеччи, M. Эванс, O. Смитис, которые в 2007 году были удостоены Нобелевской премии в области физиологии и медицины: «за открытие принципов введения специфических генетических модификаций в мышах с использованием эмбриональных стволовых клеток» .

Стволовые клетки во взрослом мозге. Есть ли они? Зачем они нужны? В отличие от ЭС клеток, являющихся плюрипотентными, СТ клетки мозга являются мультипотентными

Различия в областях мозга, контролирующих пение у птиц ( Zebra finches, зебровая амадина)

Различная форма и размеры нейронов в области мозга, отвечающей за пение.

Нейральная дифференцировка стволовых клеток мозга

Нейрогенез в системе субвентрикулярная зона/обонятельная луковица Abrous, D. N. et al. Physiol. Rev. 85: 523 -569 2005; doi: 10. 1152/physrev. 00055. 2003

FIG. во взрослом гиппокампе крысы Нейрогенез 2. Neurogenesis in the hippocampal system Abrous, D. N. et al. Physiol. Rev. 85: 523 -569 2005; doi: 10. 1152/physrev. 00055. 2003

Белковые факторы, оказывающие влияние на стволовые клетки мозга 1. EGF, FGF, GDNF, CNTF, BDNF, VEGF, PDGF и др. 2. PACAP, ANF, galanin, bone morphogenic peptide и др.

Некоторые другие факторы, оказывающие влияние на нейрогенез в нервной системе млекопитающих Двигательная активность Обучение Стрессовые воздействия

Индуцированные плюрипотентные стволовые (ИПС) клетки induced Pluripotent Stem cells (i. PS cells) Индукция плюрипотентного статуса в соматических клетках млекопитающих, включая человека, путем их репрограммирования с помощью ряда транскрипционных факторов Нобелевская премия по физиологии и медицине 2012 г. За репрограммирование дифференцированных соматических клеток Yamanaka, Гердон. Takahashi & Yamanaka (2006); Takahashi et. аl. , (2007)

Эмбриогенез Эмбриональные стволовые клетки Злокачественное перерождение (рак) Нормальное развитие организма дедифференцировка ? ? ? Дифференцировка клеток Дифференцированные клетки организма

Индукция плюрипотентности с помощью ретровирусных конструкций, содержащих транскрипционные факторы: - 4 фактора: Oct 3/4, Sox 2, c-Myc, Klf 4 (Takahashi et. аl. , 2006) Фибробласты мыши - 4 фактора: Oct 3/4, Sox 2, c-Myc, Klf 4 (Takahashi et. аl. , 2007) Фибробласты человека - 4 фактора: Oct 4, Sox 2, NANOG, LIN 28 (Junying Yu et. аl. , 2007) Фибробласты человека - 3 фактора: Oct 3/4, Sox 2, Klf 4 (Nakagava et. аl. , 2008) Фибробласты человека Эффективность составляла около 0, 01 -0, 4%

клетки фибробластов кожи человека, использованные для получения ИПС клеток А. Б. В. Б. В. Фибробласты кожи здорового человека. Фибробласты кожи пациента с болезнью Гентингтона. Фибробласты кожи пациента с болезнью Паркинсона.

Вектора и схема эксперимента по получению ИПС клеток 1 3 6 7 10 -14 ф с пк 20 -25 Дни TF TF День 1 ок TF- Oct 3/4, Sox 2, c-Myc, Klf 4 День 8 День 20 День 32 Изменение морфологии клеток в процессе репрограммирования

ЭС и ИПС клетки в культуре А Б В Г А. Эмбриональные стволовые клетки человека. Б. ИПС клетки здорового человека. В. ИПС клетки от пациента с болезнью Гентингтона. Г. ИПС клетки от пациента с болезнью Паркинсона.

Сравнение ЭС и ИПС клеток ЭС клетки ИПС клетки Плюрипотентность + + Источник Эмбрион (бластоциста) Взрослый организм Этические проблемы + - Возможность получения «больных» клеток - + Пациентоспецифичность - + Морфология Экспрессия антигенов плюрипотентности Образование эмбриоидных тел in vitro Образование тератом in vivo Образование химерных животных Сходные пути дифференцировки в клеточные типы Сходный, но не идентичный профиль экспрессии генов

Эффективный протокол дифференцировки ИПС клеток человека в нейроны Плюрипотентные стволовые клетки человека в бесфидерных условиях Образовавшиеся в присутсвии фактора Noggin нейрональные розетки механически пересевали и культивировали в суспензии После 5 дней суспензионного культивирования нейросферы высевали на адгезивную поверхность

4 дня клетки культивировали в присутствии FGF 2 для усиления пролиферации нейрональных предшественников Для направления дифференцировки в сторону клеток стриатума использовали Shh и FGF 8 Для созревания нейронов в культуральную среду добавляли GDNF, BDNF и аскорбиновую кислоту Использование данного протокола позволило получить культуры с содержанием β-III-тубулин – положительных клеток 80%, причем часть из них положительно окрашивались на тирозингидроксилазу (маркер дофаминергических нейронов.

Возможные пути применения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека 1. Исследование процессов дедифференцировки и дифференцировки клеток; стабильности генома 2. Создание клеточных моделей заболеваний человека 3. Тестирование потенциальных лекарственных препаратов 4. Индивидуальная клеточная терапия различных тяжелых заболеваний человека