МОЛЕКУЛЯРНАЯ МЕДИЦИНА СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ БИОМЕДИЦИНЫ

МОЛЕКУЛЯРНАЯ МЕДИЦИНА СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ БИОМЕДИЦИНЫ ЛЕКЦИЯ 4

ЗАДАЧИ: ДИАГНОСТИКА ЛЕЧЕНИЕ • Генные и • Лечение генов и лечение мульти-факториальные генами болезни; • Генная терапия • пренатальная диагностика ПРОФИЛАКТИКА предиктивная медицина ОСОБЕННОСТИ Молекулярной Медицины: 1. Индивидуальный характер; 2. Профилактическая направленность

общепризнанные достижения • Методы пренатальной диагностики • геномная «дактилоскопия» (точная идентификация личности) • экспериментальные и клинические основы генной терапии наследственных и ненаследственных болезней • исследования по фармакогенетике и фармакогеномике • молекулярные основы профилактической (предиктивной) медицины

генная терапия • - лечение наследственных и приобретенных заболеваний путем введения в соматические клетки пациента генетических элементов для восстановления или подавления функций генов и придания клеткам заданных свойств. включает в себя: • введение в клетки гена для восстановления недостаточной функции собственного гена, приводящей к развитию заболевания; • подавление с помощью молекулярно-генетических технологий избыточной функции собственного гена , вызывающей заболевание; • введение генов, усиливающих иммуногенность и гибель патологических клеток, а также повышающих иммунный ответ организма.

антисенс-терапия • метод лечения, основанный на выключении синтеза белка, участвующего в развитии заболевания, путем ингибирования трансляции его матричной РНК с помощью комплементарных к ней коротких нуклеотидных последовательностей (антисенс- олигонуклеотидов). • Матричная РНК (м. РНК) несет смысловую информацию об аминокислотной последовательности белка - продукта соответствующего гена. Нуклеотидная последовательность, комплементарная цепи м. РНК, называется антисмысловой последовательностью или антисенс-последовательностью (от англ. sense – смысл). • Установлено, что короткие антисмысловые нуклеотидные последовательности (антисенс-олигонуклеотиды), состоящие из 15 -40 звеньев, способны блокировать синтез белка с соответствующей м. РНК за счет образования дуплексных участков на м. РНК и создания препятствий для работы рибосомы - белок-синтезирующей молекулярной машины клетки. Антисенс- олигонуклеотиды применяются в онкологии для подавления синтеза опухолевых белков.

Проект генома человека • Идея– 1984 г. Sydney Brenner • Начало работ-1990 г. Первая версия последовательности нуклеотидов закончена в 2000 г. • Конечная версия(Build 35) – закончена в 2004 г.

• Геном (греч. окончание «ом» переводится как «весь, полный» ) исходно понимался как полный набор генов. • Геном - совокупность наследственной информации клетки или вируса, сохраняемой и передаваемой следующему поколению в виде последовательности нуклеотидов молекул ДНК (в случае некоторых вирусов–РНК). • Т. е. , геном это не только все гены, но и все остальные участки ДНК с пока неизвестной функцией.

Сидней Бреннер первым высказал идею секвенирования генома человека Сиквенс 17 миллионов пар нуклеотидов в результате одной гибридизации: техническая достижимость показана в компании Lynx Therapeutics (Genome Technol. Apr. 2001, p. 47)

Число генов у человека оценено в 20 -25 тысяч

• Сиквенс - определение последовательности нуклеотидов ДНК основано на ферментативном синтезе фрагмента ДНК, который начинается с точки генома с известными координатами, заданными структурой затравки, а заканчивается(терминиру ется) на одном из 4 -х нуклеотидов. Терминатор-Дидезоксинуклеотид Н вместо OH-группы у 3’-атома углерода

Сиквенс генома ОДНОГО человека (Сelera, 2000) : 9 месяцев, 200 млн USD(~ 3 млрд позиций, х5 каждая) План США на 10 лет: < 1000 USD/ геном N Секвенирование-непрерывный заводской процесс: 15 мин труда оператора в сутки на секвенаторе ABI Prizm 3700 Celera в 2000 г -400 секвенаторов, геном человека за два месяца

Nick Yankovsky, Nov 2001

Микрочипы могут быть использованы для диагностики и прогноза заболевания по специфическому профилю экспрессии (штрих-код), поскольку каждая болезнь(опухоль, инфекция) характеризуется, вероятно, своим изменением экспрессии генома. В разных работах невелико совпадение (напр. 30%) списков генов -предикторов по изменению экспрессии Экспрессия генов Экспрессия

• Первый в мире патент на микробиочипы для определения структуры ДНК принадлежит нашей стране, коллективу академика Андрея Мирзабекова • Он – соавтор статьи за которую дана Нобелевская премия (В. Гилберт, секвенирование ДНК) N. Novgorodpublic lecture, 4 Dec 2004 Zvenigorod 30 Nov 2005

Данный генотип(сочетание вариантов генов) предсказывает развитие фенотипа(внешне проявляемый признак) во многом, но не полностью Предрасположенность–это предсказание риска(60 -90%), а не приговор (болезни нет у близнеца в 10 -40% пар) 6 5 4 6. IQ ребенка Series 1 3 5. IQ Взрослого 4. Депрессия 2 3. Шизофрения 2. Гиперактивность 1 1. Аутизм 0 20 40 60 80 100 (Science, 16 Feb. 2001, v. 291, p. 1232)Nick Yankovsky, Nov 2001

Цель анализа экспрессии генов на чипах • 1. Выявить группы генов координировано повышающих(или понижающих) уровень транскрипции. Достижение этой цели - основа диагностики. • Предполагается, что эти гены функционально связаны через общие транскрипционные факторы и сайты их действия в данных генах. • 2. Выявить те из координировано транскрибируемых генов, которые отвечают за формирование фенотипа в ответ на воздействие (или препятствует ему). Достижение этой цели–основа терапии • Продукты работы генов могут заменить все лекарства Н. К. Янковский, ИОГен 3. 07. 2006

Гeнная инженeрия • - совокупность приёмов, методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма (клеток), осуществления манипуляций с генами и введения их в другие организмы. • Генная инженерия служит для получения желаемых качеств изменяемого организма. • Является инструментом биотехнологии, используя исследования таких биологических наук, как молекулярная биология, цитология, генетика, микробиология. • Осуществление этих двух этапов - получение гена и введение его в клетку - составляет основу той отрасли биотехнологии, которая получила название индустрии ДНК.

ЗАДАЧА ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ • получение клеток (в первую очередь бактериальных), способных в промышленных масштабах нарабатывать некоторые человеческие белки. • Так, с 1980 г. гормон роста человека соматотропин получают из бактерии Е. coli (кишечной палочки). • Соматотропин представляет собой полипептидную цепь, состоящую из 191 аминокислоты. Он вырабатывается в гипофизе и контролирует рост человеческого тела; его недостаток приводит к карликовости. • Соматотропин - единственное средство лечения детей, страдающих карликовостью из-за недостатка этого гормона.

«Красная» биотехнология • Производство биофармацевтических препаратов (протеинов, ферментов, антител) для человека, а также коррекция генетического кода. • Модификация животных и человека - Развитие методов генетической инженерии открывает широкие возможности для ускорения процесса селекции при выведении высокопродуктивных пород животных, ветеринарии высокоэффективных средств диагностики и вакцин. • молекулярные биологи научились вводить искусственные гены в живые организмы.

МЕТОД ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ • Ген, который нужно ввести в бактериальную клетку, выщепляют из ДНК хромосом человека с помощью рестрикционной эндонуклеазы, поэтому его "липкие концы" являются комплементарными нуклеотидным последовательностям на концах плазмиды. • Ферментом лигазой "сшивают" оба куска ДНК (гена и плазмиды), в результате получается рекомбинантная кольцевая плазмида, которую вводят в бактерию Е. coli.

Клонирование состоит из последовательных стадий: 1. Рестрикция - разрезание ДНК человека рестрикционной эндонуклеазой (рестриктазой) на множество различных фрагментов, но с одинаковыми липкими концами. Такие же концы получают при разрезании плазмидной ДНК той же рестриктазой. 2. Лигирование - включение фрагментов ДНК человека в плазмиды благодаря сшиванию липких концов ферментом лигазой. 3. Трансформация - введение рекомбинантных плазмид в бактериальные клетки, обработанные специальным образом - так, чтобы они на короткое время стали проницаемыми для макромолекул. 4. Скрининг - отбор среди клонов трансформированных бактерий тех, которые содержат плазмиды, несущие нужный ген человека.

Схема встраивания гена в плазмиду Плазмида – кольцевая двухцепочечная молекула ДНК, состоящая из нескольких тысяч пар нуклеотидов

Использование ретро вирусов в качестве векторов • В природе наблюдаются случаи, когда чужеродная ДНК (вируса или бактериофага) включается в генетический аппарат клетки и с помощью её обменных механизмов начинает синтезировать «свой» белок. Изучены особенности внедрения чужеродной ДНК и использованы как принцип введения генетического материала в клетку. • Принцип действия генной терапии заключается в доставке в заражённые клетки копий гена, исправляющего нарушения. Наиболее эффективным способом осуществить доставку до сих пор было встраивание нужного гена в геном вирусов , которые затем вводились в организм пациента. • Однако, ряд серьёзных неудач указал на небезопасность такого подхода. У некоторых пациентов инъекции вирусов вызывали тяжелые, иногда - смертельные, иммунные реакции.

доставка генов - процесс доставки целевых генов в ядро клетки-мишени состоит из следующих этапов: 1) упаковка генов в вектор; 2) доставка векторов к клеткам-мишеням; 3) введение генов в клетки; 4) введение генов в клеточное ядро. • Простейшим вектором для гена является плазмида – кольцевая ДНК из нескольких тысяч пар нуклеотидов, созданная методами генной инженерии. • Плазмида содержит -целевой ген и его промотор, - различные регуляторные и сигнальные последовательности, необходимые для синтеза больших количеств полноценной м. РНК и целевого белка а также - сервисные последовательности и гены, благодаря которым ее можно размножать в клетках бактерий.

Для повышения эффективности доставки генов в клетки предложено использовать: • вирусные векторы (аденовирусные, лентивирусные и др. ), • и невирусные векторы (липосомы, дендримеры, ДНК- липидные комплексы и др. ). • Адресная доставка определяется наличием на поверхности векторов специальных молекул, узнаваемых рецепторами на клетках-мишенях. • Такими молекулами могут быть белки вирусного капсида, узнаваемые рецепторами клеточной мембраны, антитела к поверхностным клеточным антигенам, встроенные в мембрану липосом, молекулы фолиевой кислоты, которые усиленно захватываются опухолевыми клетками и др.

Капсид- белковая оболочка вируса, сформированная путем самосборки одного или нескольких белков в геометрически упорядоченную структуру. • состоит из отдельных белковых субъединиц (капсомеров), организованных в один или два слоя по двум типам симметрии - кубическому или спиральному. Основные функции капсида - защита вирусного генома от внешних воздействий, обеспечение адсорбции вириона (полностью сформированной инфекционной частицы) к клетке, проникновение его в клетку путём взаимодействия с клеточными рецепторами. • Симметрично организованные вирусные частицы или полученные на основе самосборки реполимеры вирусной белковой оболочки могут применяться в качестве матриц (строительных лесов) для создания различных бионеорганических материалов: нанотрубок, наноэлектродов, наноконтейнеров. • Некоторые металлы (золото, платина) или металлосодержащие соединения (хлориды серебра, золота, платины, оксид железа, сульфиды кадмия и серы) могут связываться с белками вирусной оболочки на поверхности или во внутренней полости капсида. На основе металлизированных золотом и платиной капсидов в настоящее время разрабатываются наноустройства (нанопроводники, наноэллектроды, нанооптические зонды и др. ).

• Сегодня накапливаются клонированные фрагменты ДНК человека, ряда сельскохозяйственных животных и растений. • Коллекцию разных клонов называют клонотекой, геномной библиотекой или банком генов. • Для полной библиотеки генома человека требуется получить около 800 тыс. разных клонов. • Процесс выделения и клонирования генов в значительной степени автоматизирован.

Основная часть генома человека занята НЕ генами (63 -74%) Сам ген внутри «пустой» : 95% -некодирующая часть – Мы не знаем зачем нам столько ДНК и что делает 99% ее некодирующей части ГЕН= фрагмент геномной ДНК с котранскрибируемыми субфрагментами. Это определение гена неполное. Напр. , возможна транскрипция с 2 - х цепей.

Диагностика, основанная на Сиквенсе генома возможна: • только для Менделирующих заболеваний -собственно наследственных болезней (менделирующих, или моногенных). В мире до 10 миллионов больных Менделирующими( «простыми » ) заболеваниями. Все это болезни с детства. • В развитии и возникновении мультифакториальных (многофакторных) заболеваний (МФЗ) существенны как генетические, так и факторы внешней среды.

• В геноме человека выявлено • 1112 “генов болезней” +94“ составных” гена, образующихся при опухолевых перестройках генома • Суммарная частота менделирующих заболеваний <1% новорожденных • Мутации в кодирующей части гена–лишь часть из возможных причин потери функции. Другая часть– дефекты процессинга генетической информации (сплайсинга, регуляции транскрипции и трансляции)

Число генов, мутаций и. ДНК- диагностикумов • Тысяча разных мутаций в одном гене (CF) может быть причиной одной и той же болезни (муковисцидоз). • Для ДНК-идентификации нужны тысячи диагностикумов или пересиквенирование гена. • Около полутора тысяч генов наследственных болезней известно, и число диагностикумов составит, возможно, миллионы. • 5 -10 мутаций являются причиной болезни у 80– 90% страдающих данным заболеванием. Практически необходимое число диагностикумов–десятки тысяч. • 90% наследственных болезней не моногенны от природы. Число диагностикумов для них–сотни тысяч.

Связь мутации с проявлением болезни зависит от генетического фона для данной мутации • Вариант генетического текста( аллель) определенного гена может приводить к предрасположенности к заболеванию в одних этнических группах и быть нейтральным в других группах, т. е. связь генотипа с фенотипом зависит от генетического фона для данной мутации. • • Для жителей Восточной Азии достаточны меньшие дозы, чем для Европейцев приеме психотропных препаратов(антидепрессанты, нейролептики) • • Китайцы более чувствительны, чем Европейцы к бетаблокаторам, снижающим пульс и давление крови

• Раннее развитие алкогольной зависимости и острого алкогольного психоза: • Предрасположенность может быть повышена до 10 раз, что может быть выявлено пренатально при некоторых генотипах, специфичных для данного генетического фона (по. Э. К. Хуснутдиновой, ИБи. ГРАН, Уфа) Сочетания генотипов и относительный риск Для мужчин русской национальности: • 9/9 или 9/10 гена переносчика дофаминаи. G/G гена 2 Арецептора серотонина(OR = 3, 41), • A 1/A 2, N 1/N 2 или. A 2/A 2, N 2/N 2 гена. D 2 рецептора дофамина с. G/G гена 2 Арецепт. Серотонина (OR = 5, 46). • аллели 456 и 209 двух локусов гена моноаминоксидазы Аи. L/L гена переносчика серотонина(OR = 9, 08). Для мужчин татарской национальности: 209 двух локусов гена моноаминоксидазы. Аи. G/G гена переносчика ДОФАМИНА; A 2/A 2 гена D 2 рецепт. дофамина, 9/9 и 9/10 гена переносчика дофамина и. G/G гена 2 А рецептора серотонина(OR = 7, 47). аллели 456 и 239 двух локусов гена моноаминоксидазы. Аи. L/S гена переносчика серотонина(OR = 9, 50). Для мужчин башкирской национальности: аллели 456 и 209 двух локусов гена моноаминоксидазы. Аи. L/S гена- переносчика серотонина(OR = 6, 1)

• Роль генетических факторов в индивидуальной реакции организма человека на лекарственные препараты и неблагоприятные экологические воздействия впервые показана в 1958 году Фогель, Мотульский(США), Калов(Канада). • Гены детоксикаци и ксенобиотиков получили название генов "внешней среды"

Фактор риска ФЕНОЛ полициклические ароматические гидрокарбонаты • Рак легких, желудка, • 1. Сталелитейная промышленность • кожи • 2. производство алюминия • Лейкемия • 3. Химические • Нарушение производства(производство репродуктивной красок, фенола, резины и т. д. ) системы • 4. Нефтеперерабатывающие заводы • 5. Строительство дорог Риск заболевания Делеция гена GSTM 1 (del/del) увеличен в 5. 94 раза

Детоксикация ксенобиотиков В организме человека детоксикацию ксенобиотиков (промышленных загрязнений, сельскохозяйственных ядов и фармакологических препаратов) осуществляют специальные ферментные системы и мембраноассоциированные рецепторы, регулирующие их активность, которые получили название "лекарственно-метаболизирующие энзимы". Процесс детоксикации обычно включает две последовательные фазы. (фаза 1 детоксикации) Сначала поступающие в организм чужеродные соединения (канцерогены, лекарства, промышленныя яды и пр. ) активируются с помощью ферментов семейства цитохромов Р 450 или микросомальных эпоксид- гидролаз (m. EPOX), образуя короткоживущие промежуточные электрофильные метаболиты, которые обладают генотоксическими свойствами. (фаза 2 детоксикации) Промежуточные метаболиты с помощью ферментов семейств глутатионтрансферазы (GSTM) , УДФ- глюкуронсульфотрансфераз (UDF) , N-ацетилтрансфераз (NAT) превращаются в водорастворимые нетоксические продукты и выводятся из организма.

ОСНОВНЫЕ ФАЗЫ ДЕТОКСИКАЦИИ КСЕНБИОТИКОВ ИМПОРТ АКТИВАЦИЯ ДЕТОКСИКАЦИЯ ЭВАКУАЦИЯ КСЕНОБИОТИКОВ АКТИВНЫХ ВЫВЕДЕНИЕ ПРОМЕЖУТОЧНЫХ ВОДОРАСТВОРИМЫХ МЕТАБОЛИТОВ НЕТОКСИЧНЫХ КОМПОНЕНТОВ ФАЗАIII ФАЗАI ФАЗАII ИСХОДНЫЙ АКТИВНЫЕ ВОДОРАСТВОРИМЫЕ ПРОМЕЖТУТОЧНЫЕ НЕТОКСИЧНЫЕ КСЕНОБИОТИК ЭЛЕКТРОФИЛЬНЫЕ КОМПОНЕНТЫ МЕТАБОЛИТЫ ЦИТОХРОМЫ Р 450 ГЛЮТАТИОНТРАНСФЕРАЗЫ ЭПОКСИДГИДРОЛАЗЫ N-АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗЫ ДЕГИДРОГЕНАЗЫ UDPГЛЮКУРОНСУЛЬФОТРАНСФЕРАЗЫ ОТРАВЛЯЮТ КЛЕТКУ, ВЫЗЫВАЮТ МУТАЦИИ И РАК

Организм выводит все чужеродные вещества (ксенобиотики), попадающие в него • От входа до выхода ксенобиотика из организма клетки, как правило, должны сделать его доступным для соответствующих систем, что требует химической модификации исходного КБ, т. е. его метаболизма • Метаболиты, образуемые в организме из ксенобиотиков, более реакционно способны, чем исходный КБ, и потому часто • 1) более биологически эффективны(образование активной действующей формы лекарств в организме) 2) более опасны (образование токсинов, мутагенов и канцерогенов из слаботоксичных предшествеников).

• Вывод ксенобиотиков сопровождается их химической модификацией, которая приводит к образованию промежуточных соединений, некоторые из которых могут быть токсичны ТОКСИФИКАЦИЯ КСЕНОБИОТИКОВ СИСТЕМОЙ ЦИТОХРОМОВ Р – 450 • Хлороформ CHCl 3 ------ Фосген Cl 2 C=O • Парацетамол ---- метаболит, повреждающий печень и почки • Бензпирен (содержится в выхлопных газах автомобиля -----Дигидроксиэпоксид (канцероген)

Высокая мощность ферментов Фазы I на главных путях поступления Ксенобиотиков в организм: пищевом – печень, желудочно- кишечныйтракт; дыхательном – легкие Изоферменты тканеспецифичны

• Фосфорорганические соединения детоксицируются с участием белка плазмы крови – фермента ПАРАОКСАНАЗЫ (ген РОN) • Генетически детерминировано наличие у человека высоко- или низкоактивной формы этого фермента • Люди с высокоактивной формой параоксаназы менее восприимчивы к действию фосфорорганических соединений • Вариабельность чувствительности американских солдат (Gulf War Syndrome) к действию фосфорорганических веществ, которые применялись при военных действиях в Персидском заливе. • Разная чувствительность людей к зарину во время атаки в Японском метро. • Низкоактивная форма выявляется у 50% белых американцев, реже встречается у индейцев и африканцев

Гены детоксикации ФАЗЫ II - ГЛУТАТИОНТРАНСФЕРАЗЫ • Глутатион-S-трансферазы катализируют взаимодействие глутамата с электрофильными атомами C, N, S, O широкого спектра соединений. • Они осуществляют ферментную конъюгацию сульфгидрильной группы SH 2 c органическими электрофильными молекулами ксенобиотиков. • Детоксикация ксенобиотиков глутатионтранс- феразами играет ключевую роль в предотвращении деструкции ДНК. • Особенно высока их концентрация в плаценте, печени, почках, легких, мозге и кишечнике.

Основные практические цели медгенетики пока не достижимы «Менделирующие» болезни Есть1 мутантный ген=>есть болезнь. Примеры–гемофилия, фенилкетонурия, Огромный прогресс в понимании и диагностике за 10 лет. • Доля этих болезней мала <10% из всех болезней человека (<3000 из примерно 30 000) • Частота этих болезней мала -<2% людей поражено. Это болезни детства Комплексные заболевания Несколько генов с мутациями=> одна болезнь. Примеры–сердечно-сосудистые, почти нет прогресса в понимании и диагностике за 10 лет • Доля этих болезней велика (их>90%) • Частота этих болезней велика «>100%» (по паре на каждого) Это болезни активной части населения Проблема: • Присутствие у индивида аллеля более частого у больных не является ни необходимым, ни достаточным для проявления фенотипа «заболевание»

Ведущие причины смерти от болезней • Основные гены распространенных заболеваний будут идентифицированы за 5 -7 лет • Только в 1700 генах выявлены мутации, вовлеченные в развитие менделирующих наследственных заболеваний. • Но 3 -я по частоте(20%) причина смерти в США- не то или не так лекарство прописали!

Выводы: • Известны основные участки генома, важные для метаболизма ксенобиотиков. • Известно состояние этих участков, определяющих повышенную чувствительность или устойчивость к ксенобиотикам. Каждое из этих состояний может быть выявлено в том числе до рождения. • Частоты встречаемости данных состояний уникальны и постоянны на данной территории и у данного Сочетания неблагоприятных состояний дают кумулятивный эффект. • Известна повышенная вредность определенных факторов среды. Сочетание неблагоприятных факторов дает кумулятивный эффект, Оно уникально и постоянно на данном производстве. • Сочетание генетических и средовых факторов риска – Уникальная и фиксированная характеристика данного производства.