МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА Репликация ДНК процесс у прокариот Лекция

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА Репликация ДНК: процесс у прокариот Лекция 6

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА. РЕПЛИКАЦИЯ Словарик

Словарик Клеточный цикл – период жизни клетки от одного деления до другого или от деления до смерти Репликативная вилка – Y-образная структура, перемещающаяся вдоль родительской спирали ДНК и характеризующаяся местным расхождением двух её цепей, в пределах которой происходит активная репликация ДНК Ориджин (ori)– участок репликона, с которого начинается процесс репликации

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА. РЕПЛИКАЦИЯ Общая характеристика процесса

Репликация – полимеразная реакция, обеспечивающая процесс матричного синтеза молекулы ДНК и приводящая к ее самовоспроизведению (удвоению).

Основные структурные элементы ЭЛЕМЕНТЫ РЕПЛИКОН ОРИДЖИН РЕПЛИКАТИВНАЯ ВИЛКА

Репликонные системы

Ориджины репликации Сборка белковых комплексов и формированние репликативной вилки начинается в определенной участке ДНК – Origin (Ori) Схема ori вируса SV 40 ORE (origin recognition element) – участок связывания белка Т-антигена (Т-аg) DUE (DNA unwinding element) – участок для связывания белка, расплетающего ДНК ТА – элемент, обогащенный АТ-нуклеотидами OBR (origin bidirectional replication) – начало двунаправленной репликации Аux-1 – вспомогательный элемент, связывает димеры Т-антигена Аuх-2 – связывает фактор транскрипции Sp 1

Формы движения репликативной вилки

Одноправленная репликативная вилка

Двунаправленная репликативная вилка

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА. РЕПЛИКАЦИЯ Основные стадии репликации

Инициация • Образование пререпликативного комплекса • Формирование репликативной вилки Элонгация • Продолжение процесса репликации, рост дочерней цепи ДНК Терминация • Завершение процесса репликации

Хромосома E. coli (4, 2 млн. п. н. ) – один репликон

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА. РЕПЛИКАЦИЯ Репликация ДНК у прокариот

ДНК-полимеразы прокариот (E. coli)

ДНК-полимеразы прокариот ДНК-полимераза III является репликазой, синтезирует обе цепи ДНК, обладает активностью 5’ → 3’ полимеразной и 3’ → 5’ экзонуклеазной ДНК-полимеразы I действует на запаздывающей цепи для удаления РНК-праймеров (5’ → 3’ экзонуклеазы) и дорепликации очищенных мест ДНК, выполняет репаративную функцию, обладает активностью 5’ → 3’ полимеразной и 3’ → 5’ экзонуклеазной ДНК-полимераза II имеет отношение лишь к репарации, обладает активностью 5’ → 3’ полимеразной и 3’ → 5’ экзонуклеазной

Общий принцип строения ДНК-полимераз По форме ДНКполимеразы можно уподобить полураскрытой кисти правой руки, в которой ладонь, большой палец и остальные пальцы представляют три основных пространственных домена и формируют полость, удерживающую ДНКматрицу и затравку в ходе синтеза. « Пальцы» удерживают однонитевую матрицу, а « большой палец» прижимает праймер – матричный двунитевой участок.

Скользящий зажим и погрузчик зажима ДНК-полимеразы работают совместно с различными белковыми комплексами, удерживающими их в вилке репликации. Их называют «зажим» и «загрузчик зажима» ( «sliding clamp» , «clamp loader» ).

Скользящий зажим и погрузчик зажима После объединения ДНК-полимеразы с зажимом, «загрузчик зажима» отходит от места реакции, но держится поближе к отстающей нити, чтобы провести загрузку на новом месте объединения праймерматрица, как только ДНК-полимераза диссоциирует при завершении синтеза предыдущего фрагмента Оказаки.

ДНК полимеразы прокариот: ДНК полимераза III Осуществляет синтез ведущей цепи ДНК и фрагментов Оказаки при синтезе отстающей цепи. Holo-фермент состоит из 10 субъединиц, каждая из которых обладает своей функцией.

ДНК полимераза I состоит из одной субъединицы (109 к. ДА) длиной 928 остатков, которую можно разделить на три домена : N-концевую треть молекулы занимает (5’→ 3’)-экзонуклеазный домен, в центре расположен самый короткий (3’→ 5’)-экзонуклеазный домен, а самый большой полимеразный домен находится на С-конце.

ДНК полимеразы прокариот: ДНК полимераза I

ДНК полимеразы прокариот: ДНК полимераза II ДНК-полимераза II (состоит из N-концевого (3’→ 5’)экзонуклеазного домена и более длинного Сконцевого полимеразного домена, не обладает 5’экзонуклеазной активностью, лигируют повреждённую цепь ДНК

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА. РЕПЛИКАЦИЯ Стадия инициации у прокариот

Общая схема репликация E. coli ГИСТОНОПОДОБНЫЕ БЕЛКИ: HU (…), IHF (integration host factor), FIS (factor for inversion stimulation) НЕ – HOLE-фермент

Формирование пререпликативного комплекса и репликативной вилки Репликация в оri. С начинается с формирования комплекса, в состав которого входят шесть белков: Dna. А, Dna. В, Dna. С, НU, Girase и SSВ Структура (ori С) E. coli Особенности структуры ДНК Ori-участков: 1. негативная суперспирализация ДНК 2. присутствием «легкоплавких» А-Т участков ДНК 3. Места для связывания со вспомогательными белками

Белок Dna. A Функции: 1) узнает область начала репликации ori. C, последовательно связываясь с нонамерными повторами в ДНК – блоками Dna. A 2) способствует расплетанию легкоплавких АТ-богатых участков ДНК ori. C 3) вербует на расплетенные участки ori. C Dna. B (хеликазу) Структура белка Dna. A E. coli. I-IV - области гомологии бактериальных белков Dna. A 1 - домен олигомеризации 2 - области связывания с хеликазой Dna. В, 3 - сайт связывания нуклеотидов 4 - домен АТФазной активности 5 - участок взаимодействия с мембранными фосфолипидами 6 - домен связывания с ДНК

Связывание инициаторного белка Dna A c ДНК Сначала с 9 pb последовательностью связывается мономер Dna. А, затем 20– 40 мономеров этого белка формируют большой агрегат. ДНК ориджина опоясывает его, и цепи ДНК разъединяются в области трех 13 pb последовательностей. На следующем этапе димер Dna. В/Dпа. С присоединяется к комплексу ori. С/Dna. А – формируется репликативная вилка.

а) присоединение Dna. А (инициирующий белок) b) присоединение Dna. B (хеликазы) c) Присоединение и Dna. G (праймазы) – образование праймосомы , комплекса, содержащего хеликазу и праймазу

Dna. В расплетает двухцепочечную ДНК при использовании энергии АТФ. Скорость расплетения составляет около 6000 нукл. в сек.

SSB-белки удерживают одноцепочечные ДНК от ассоциации. По мере продвижения репликационной вилки SSB диссоциируют с одного места и присоединяются на другом. Этот процесс не требует затрат энергии АТФ.

Формируется праймосома. Фермент праймаза синтезирует праймеры. ДНК-полимераза III присоединяет к праймеру первый нуклеотид.

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА. РЕПЛИКАЦИЯ Стадия элонгации у прокариот

ДНК-полимераза III присоединяет к праймеру следующий нуклеотид. Идет синтез ведущей и отстающей цепи. Обе цепи реплицируются синхронно, что достигается взаимодействием хеликазы, праймазы и ДНК-полимеразы и торможением синтеза лидирующей цепи во время синтеза праймеров.

Когда синтез на одном из фрагментов Оказаки достигает праймера другого фрагмента ДНК-полимераза I удаляет праймер, имеющейся у полимераз 5‘ → 3' экзонуклеазной и 5’ → 3’ полимеразной активностью (исключение праймера). После этого сахарофосфатный остов между фрагментами сшивается ковалентной связью при помощи ДНК-лигазы.

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА. РЕПЛИКАЦИЯ Стадия терминации у прокариот

Организация репликона E. coli aattagtatgttgtaactaaagt tus (tbp) 36 к. Да Терминация репликации у прокариот происходит, когда «репликационная вилка» достигает участка ДНК с особыми сайтами ter и, если с ДНК этих сайтов соединится продукт гена tus.

Общая схема репликации у прокариот Последовательность событий 1. Dna. A узнает Dna. A Box (регуляторный элемент около Ori), что приводит к к расплетанию DNA в Ori 2. Хеликазы Dna. B и Dna. C связывают репликативную вилку с противоположных сторон 3. Dna. G (праймаза) присоединяется к комплексу, Dna. C высвобождается, остается комплекс xеликазы (Dna. B) и праймазы (Dna. G) 4. Хеликаза (Dna. B) расплетает DNA, присоединяются белки SSB 5. Dna. G (праймаза) синтезирует праймер 6. ДНК-полимераза III синтезирует лидирующую цепь и отстающую цепи 7. ДНК-полимераза I заменяет праймер, ДНК-лигаза сшивает фрагменты 8. Tus белки связываются с ter-последовательностями и останавливают репликацию 9. Топоизомераза IV разъединяет ДНК