Молекулярная генетика ЛИТЕРАТУРА •

Молекулярная генетика

ЛИТЕРАТУРА • Стент Г. , Кэлиндар Р. Молекулярная генетика. М. , Мир, 1981. • Айала Ф. , Кайгер Д. . Современная генетика. М. : Мир. 1988 (Т. 2). • Албертс Б. , Брей Д. , Льюис Дж. , Рэфф М. , Робертс К. , Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки. М. , Мир, 1994, том 1, том 2. • Инге-Вечтомов С. Г. Введение в молекулярную генетику. М. , Высшая школа, 1983. • Патрушев Л. И. Экспрессия генов. М. Наука, 2000. • Патрушев Л. И. Искусственные генетические системы. Т. 1 Генная и клеточная инженерия. М. Наука, 2004. • Сингер М. , Берг П. Гены и геномы. М. , Мир, 1998, том 1, том 2. • Агол В. И. , Богданов А. А. , Гвоздев В. А. и др. ; под ред. А. С. Спирина. Молекулярная биология: Структура и биосинтез нуклеиновых кислот. М. , Высшая школа, 1990. • Льюин Б. Гены. М. , Мир, 1987. • Хесин Р. Б. Непостоянство генома. М. , Наука, 1984.

Молекулярная генетика • - это наука о механизмах воспроизведения, реализации, передачи и хранения генетической информации • - это раздел генетики, описывающий структурно- функциональную организацию генетического аппарата живых систем, а также и механизмы его реализации

Основные этапы развития молекулярной генетики 1868 г. Обнаружен нуклеин. Его современное название - хроматин. Фридрих Мишер 1889 г. Показано, что нуклеин содержит нуклеиновую кислоту и белок. Введен термин "нуклеиновая кислота". Рихард Альтман 1900 г. Установлена структура азотистых оснований. 1909 г. В нуклеиновых кислотах обнаружены фосфорная кислота и рибоза. Левин 1930 г. Найдена дезоксирибоза. Левин 1938 г. Методом рентгеноструктурного анализа показано, что расстояние между нуклеотидами в ДНК равно 3, 4 Å. Азотистые основания в ДНК уложены стопками. Уильям Астбюри, Флорин Белл 1940 г. Сформулирована гипотеза - "Один ген - один фермент". Джордж Бидл и Эдуард Татум 1944 г. Получены доказательства генетической роли ДНК. Освальд Эйвери, Колин Мак-Леод, Маклин Мак-Карти

1947 г. Установлено, что в ДНК есть водородные связи между группами N-H и C=O. Гулланд 1953 г. С помощью кислотного гидролиза ДНК с последующей хроматографией и количественным анализом установлены закономерности: А/Т=1; Г/Ц=1; (Г+Ц)/(А+Т)=К - коэффициент специфичности, постоянен для каждого вида. Эрвин Чаргафф 1953 г. Установление структуры ДНК. Джеймс Уотсон, Френсис Крик 1961 г. Открытие генетической регуляции синтеза ферментов. Андре Львов, Франсуа Жакоб, Жак Моно 1962 г. Расшифровка генетического кода. Маршалл Нирнберг, Генрих Маттеи, Северо Очоа 1953 - Сформулирована центральная догма молекулярной 1962 гг. биологии - перенос генетической информации идет в направлении ДНК→РНК→белок 1967 г. Синтез in vitro биологически активной ДНК. Артур Корнберг

1970 г. Химический синтез гена. Гобинд Корана 1970 г. Открытие фермента обратной транскриптазы и явления обратной транскрипции. Говард Темин, Дэвид Балтимор, Ренато Дульбеко 1974 г. Открытие рестриктаз. Гамильтон Смит, Даниэль Натанс, Вернер Арбер 1978 г. Открытие сплайсинга. Филипп Шарп 1982 г. Открытие автосплайсинга. Томас Чек 1990 - Инициирован проект «Геном человека» , информация о 1992 последовательностях генов начала увеличиваться экспоненциально 1997 Расшифрован геном E. coli K 12 -MG 1655 (4, 6 Mbp) 2000 расшифрован геном Dr. melanogaster (137 Mbp) Расшифрован геном A. thalianar (115 Mbp) 2001 Расшифрован геном человека 2006 – Реализация программ по секвенированию геномов про- и 2009 эукариот

Микроорганизмы (бактерии и фаги) как объект генетических исследований • Геномы организмов относительно просты в организации • Быстро размножаются, легко культивируются на искусственных средах • Можно получить потомство от одной исходной клетки, а именно - колонии генотипически однородных клеток • Возможно изучение фенотипического проявления генов на биохимическом уровне по проявлению действия отдельных ферментов • Можно легко получить разнообразные мутации – Например, используются ауксотрофные мутации - мутации связанные с утерей способности к синтезу какого – либо соединения, при этом если в среду добавить вещество, синтез которого утрачен – клетки способны расти на селективной (минимальной) питательной среде, в отличии от клеток дикого типа, называемых прототрофными (эти клетки способны к синтезу)

Рост данных в Gen. Bank Dennis A. Benson, et. al. , Nucleic Acids Research, 1995 -05

Полностью расшифрованные геномы 26 Архебактерии 294 Эубактерии 41 Эукариоты http: //www. genomesonline. org/

Комментарий к расшифровке генома E. coli

Размеры геномов и число генов разных организмов Доля «существенных» для жизнеспособности генов падает с увеличением числа генов в геноме ?

Обратная генетика Генетический анализ «от гена к признаку» : • из имеющейся библиотеки генов выбирают клон, в котором по данным копьютерного анализа может находиться генетически значимая последовательность • эту последовательность клонируют • целенаправленно получают в ней мутацию • вводят мутантный ген в клетки • проводят анализ фенотипических нарушений Обратная генетика позволяет установить функции генов, время их работы в онтогенезе, определить количество работающих генов в различные моменты жизни организма Вычислительная информационная биология

Нуклеиновые кислоты – НОСИТЕЛИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ - это нерегулярные полимеры, мономерами которых являются нуклеотиды

В силу пространственного расположения сахарофосфатного остова и нуклеотидов, когда нуклеотиды накладываются один на другой и «сшиваются» через сахарофосфатный остов, цепочка начинает заворачиваться, тем самым образуя знаменитую двойную спираль.

• В-форма – это основная форма спирали – на виток приходится 10 комплементарных пар – плоскости азотистых оснований перпендикулярны оси спирали Формы двойной спирали ДНК – соседние комплементарные пары повернуты друг относительно друга на 36° – диаметр спирали 20Å, причем пуриновый нуклеотид занимает 12Å, а пиримидиновый - 8Å. • А-форма – – 11 пар азотистых оснований на виток – плоскости азотистых оснований отклонены от нормали к оси спирали на 20, отсюда следует наличие внутренней пустоты диаметром 5Å – высота витка 28Å – такие же параметры у гибрида из одной цепи ДНК и одной цепи РНК. • С-форма – – шаг спирали 31Å, 9. 3 пар оснований на виток, угол наклона к перпендикуляру 6 • Все три формы - правозакрученные спирали • Z -форма – это единственная левая спираль • высота витка в Z-форме -44. 5 Å, на виток приходится 12 пар нуклеотидов • ни А-, ни Z- формы не могут существовать в водном растворе без дополнительных воздействий (белки или суперспирализация).

Информационная емкость ДНК На Земле живет около 6 миллиардов человек. У всех людей ~ 30 х1013 генов или 30 х1016 пар нуклеотидов, которые составляют 1017 кодонов Наследственная информация о населении Земли заключена в 6 х109 половых клетках (сперматозоидах). • такое количество сперматозоидов занимают половину наперстка, а их ДНК занимает менее четверти наперстка. • ДНК 6 х109 сперматозоидов содержит информацию, равную по объему примерно 4 х1013 книжных страниц. • средняя книжная страница содержит 25 х102 знаков, эти страницы заняли бы объем 6 -и зданий среднего размера. .

Длина ДНК в организме одного человека в тысячу раз превышает расстояние от Земли до Солнца (2 набора по 1, 5 м в 5 х1013 клеток = 10 14 м) По разным оценкам у человека от 30 до 50 тысяч генов – 100 новых генеративных мутаций отличают геном ребенка от маминого – 2 000 мутаций отличает папину половину генома ребенка от маминой (1 SNP на 1250 п. н. ) Подавляющая часть наследственной изменчивости НЕ мутационная, а комбинаторная - став взрослым, человек накапливает >1015 мутаций (миллион миллиардов) в клетках организма ( 10 -8 мутаций на репликацию) – для всего человечества их описано <10 миллионов SNP.

Функции ДНК Носитель генетической информации - функция обеспечивается генетическим кодом Воспроизведение и передача генетической информации в поколениях клеток и организмов - функция обеспечивается процессом репликации Реализация генетической информации - функция обеспечивается процессами транскрипции и трансляции

Отличия между ДНК и РНК ДНК РНК Сахар Дезоксирибоза Рибоза Азотистые А, У, Г, Ц А, Т, Г, Ц основания 99. 99% Количество цепей в 99. 99% двойная спираль одноцепочечная молекуле 0. 01% одноцепочечная 0. 01% двухцепочечная Все одноцепочечные- кольцевые Линейные Форма молекулы Большинство двухцепочечных молекулы - линейные, часть - кольцевые

Виды РНК Размер в нуклеотидах g. РНК – геномные РНК 10000 -100000 m. РНК - информационные 100 -100000 (матричные) РНК t. PHK - транспортные РНК 70 -90 несколько дискретных классов от r. РНК - рибосомные РНК 100 до 500000 s. РНК - малые РНК 100 -300

Генетический контроль и энзимология генетических процессов

Репликация ДНК • Это процесс образования идентичных копий ДНК, осуществляемый комплексом ферментов и белков, выполняющих топологическую функцию • Цель процесса - передача генетической информации в поколениях клеток и организмов • Принципы репликации • Комплементарность. • Антипараллельность. • Униполярность. • Потребность в затравке. • Прерывистость. • Полуконсервативность. • Первые три принципа можно сформулировать в одной фразе: синтез каждой дочерней цепи ДНК идет комплементарно и антипараллельно матричной цепи и всегда в направлении 5' → 3'

• Полуконсервативность означает, что каждая дочерняя ДНК Доказательство состоит из одной матричной цепи и одной вновь полуконсервативного синтезированной. • E. сoli выращивали на среде, характера репликации содержащей тяжелый изотоп азота (N 15), для того, чтобы вся ДНК была "тяжелой". Перед очередным раундом деления в среде заменяли N 15 на легкий изотоп N 14 с тем, чтобы вновь синтезированные цепи были "легкими". После этого ДНК центрифугировали в градиенте плотности Cs. Cl, который разработали. Мэтт Мезельсон и Фрэнк Сталь в 1958 г. ДНК разделяется не по молекулярным весам, а по удельной плотности. • Клетки второго поколения содержали как полностью "легкие" молекулы, так и "гибридные", состоящие из одной "легкой" и одной

Ферментативная • В 1956 г. А. Корнберг из 100 кг биомассы E. coli и выделил 0. 5 г система синтеза • фермента ДНК-полимеразы Необходимые компоненты для ДНК in vitro синтеза ДНК in vitro: – ДНК-матрица - образец, по которому строится новая цепь ДНК. – активированные нуклеотиды (d. АТФ, d. ГТФ, d. ТТФ, d. ЦТФ) - то, из чего строятся дочерние цепи. – ДНК-полимераза - то, что строит новую цепь ДНК. – ионы магния - то, без чего фермент не работает. • Нативная двуцепочечная ДНК, не может эффективно использоваться в этой системе. • ДНК-матрицу необходимо активировать. – денатурацией щелочью или нагреванием (1), – обработкой экзонуклеазой III из E. сoli (2), – внесением ников (одноцепочечных разрывов) с помощью эндонуклеаз (3).

Матрица и затравка • Во всех случаях матрицей для синтеза новых цепей служит одноцепочечная ДНК. Затравкой является 3'- гидроксильный конец двуцепочечной ДНК, причем он должен быть спарен с матрицей. • В том случае, если эндонуклеаза вносила ники с 3'-фосфатным концом, ДНК не являлась активированной.

• Прямым доказательством того, что затравкой является 3'- гидроксильный конец, служит эксперимент с дидезоксинуклеозидтрифосфа том – если такой активированный нуклеотид сделать меченым по α-фосфату, то он включается в растущую полимерную цепь и всегда обнаруживается на ее 3' -конце. Это говорит о том, что он сам включается, но дальнейший рост цепи невозможен, т. к. нет 3'- гидроксильного конца • Это также доказывает и униполярность репликации в направлении 5'→ 3'

Строение и свойства ДНК-полимеразы Корнберга (ДНК-полимеразы I) • это одна полипептидная цепь с молекулярным весом 109 тыс. • в состав полимеразы входят ионы цинка, она абсолютно зависима от ионов магния. • Обнаружены разные каталитические активности ДНК - полимеразы I: – Полимеризационная в направлении 5`→ 3`. Фермент работает только тогда, когда он находится на молекуле ДНК и имеет соответствующую конформацию – Гидролитическая активность: Гидролитическая активность проявляется в направлении 3'→ 5' и 5'→ 3‘ • Активность 3‘ → 5' проявляется на неспаренном 3'- гидроксильном конце. Фермент возвращается при ошибке включения и "откусывает" неправильный нуклеотид. Это корректорская функция фермента. • Все ДНК-полимеразы обладают этой активностью.

• Фермент способен гидролизовать спаренный 5'- конец, расчищая себе дорогу и продолжая полимеризацию. • Если на пути фермента встречается короткий (меньше 10 нуклеотидов) неспаренный 5'- конец, то полимераза сначала проявляет эндонуклеазную активность и откусывает весь свисающий конец, а затем проявляет экзонуклеазную 5'→ 3' активность т. е. откусывает по одному нуклеотиду. • Если неспаренный 5'-конец длинный, то фермент использует его как матрицу. • При мягком расщеплении ДНК- полимеразы трипсином можно получить два активных фрагмента: один обладает полимеразной и 3'→ 5' гидролитической активностью (фрагмент Кленова), другой - 5'→ 3' гидролитической активностью

Схема • 1960 г. Гипотетическая непрерывной модель • Суть: антипараллельной • неизвестный фактор репликации in vivo денатурирует концы линейной молекулы по Корнбергу • 3'-ОН-концы загибаются и служат затравками для работы ДНК-полимеразы • фермент осуществляет денатурацию матричной ДНК по мере продвижения и синтеза дочерних цепей • на выходе - дочерние молекулы, которые короче на загнутый конец, т. к. эндонуклеаза вносит разрыв в материнскую цепь

Сравнительные характеристики ДНК-полимераз E. сoli ДНК- Функция полимераза III II Полимеризация в 5'→ 3' направлении + + Гидролитическая активность 3'→ 5' + + Гидролитическая активность 5' → 3' + – Потребность в матрице-затравке: Нативная двуцепочечная ДНК – – Одноцепочечная ДНК с олигонуклеотидной затравкой + – 2 -х цепочечная ДНК с ником + – или с пробелом меньше 100 нуклеотидов + +

или с пробелом больше + – – 100 нуклеотидов Оптимальная Активность концентрация KCl 20 м. М 60% 100% 50 м. М 80% 100% 50% 100 м. М 100% 70% 150 м. М 80% 50% 0% Влияние 10% этанола 40% 45% 200% Молекулярный вес (к. Да) субъе 109 120 динич. состав Число оборотов, принимая за единицу 667 1 0. 05 15 нукл/мин. Число молекул на клетку 250 100 20

Схема прерывистой антипараллельной репликации Рейджи Оказаки 1968 г. • Исходные посылки: – данные Корнберга, полученные в ферментативной системе in vitro – "картинки" Кэрнса • Оказаки специально разработал два новых метода исследования. • Оказаки считал, что время Кэрнса (5 мин. ) очень велико для получения истинной картины происходящего при репликации. • Метод импульсного мечения. До Оказаки метку вводили в среду, эатем быстро отмывали клетки, но минимальное время подачи метки было 5 мин. – Оказаки через короткий момент времени после добавления меченого тимидина давал 1000 -кратный избыток холодного (немеченого) тимидина. Таким образом, метка включается только в течение очень короткого времени. Центрифугирование в щелочном градиенте сахарозы. Сахароза готовится на щелочи. В щелочной среде происходит денатурация ДНК. В этом случае короткие фрагменты ДНК, если они есть, отделяются от длинных. После этого их можно выявить при центрифугировании в градиенте плотности сахарозы, разделяющем молекулы по молекулярному весу. • Оказаки предположил, что синтез ДНК идет короткими фрагментами и что короткие фрагменты должны сшиваться.

• Размер фрагментов Оказаки видоспецифичен и составляет для – фагов 1000 -2000 н – E. сoli - 1000 н – для эукариот - 200 -400 н

• К репликации имеют отношение полимеразы I и III – ДНК-полимераза I обладает вспомогательной, репаративной функцией – Именно полимераза III синтезирует in vivo новые цепи ДНК • ДНК-полимераза II имеет отношение лишь к репарации

Размеры геномов и число генов разных организмов Доля «существенных» для жизнеспособности генов падает с увеличением числа генов в геноме ?