Молекулярная диагностика выявление патогенных мутаций в образцах ДНК

Молекулярная диагностика: выявление патогенных мутаций в образцах ДНК и РНК с целью диагностики, классификации, прогноза и мониторинга ответа на терапию Методы, основанные на выявлении локализации, определении структуры и функциональной активности генов, опосредующих развитие заболеваний

Объекты молекулярной диагностики Геномная ДНК Транскрипция м. РНК Трансляция Определение последовательности (секвенирование) Определение мутаций и полиморфизмов с помощью ПЦР Выявление хромосомных аберраций белок Определение состава, количества и локализации белков Определение состава, количества и локализации РНК

Молекулярная диагностика в медицине Технологии Области применения Технологии ПЦР Профилактика Гибридизация in situ (FISH) Клиническая диагностика Нанотехнологии Судмедэкспертиза Биочипы Фармацевтическая промышленность Пептидные нуклеиновые кислоты Биологическое оружие Протеомные технологии Разработка новых лекарств Электрохимическое выявление ДНК M. Debnath et al. , Molecular Diagnostics: Promises and Possibilities, DOI 10. 1007/97890 -481 -3261 -4_1, C Springer Science+Business Media B. V. 2010

«Тераностика» Онкология (цетуксимаб, дазатиниб, эрлотиниб, гефитиниб, иматиниб, лапатиниб, трастузумаб и т. д. ) Трансплантология (азатиоприн) ВИЧ /СПИД (абакавир, маара-вирок)

Комплементарность нуклеотидов: основа методов детекции нуклеиновых кислот

Выделение нуклеиновых кислот Экстракция фенолом/хлороформом, переосаждение этанолом выделение всего спектра нуклеиновых кислот С помощью сорбции на микропористый оксид кремния (мембраны, колонки) автоматизация выделения

Секвенирование ДНК Энзиматическая (Sanger, 1977) или химическая (Maxam and Gilbert, 1977) деградация сепарация полученных фрагментов и анализ их длины С помощью синтеза (Ansorge, 1991) детекция вновь встраиваемого флуорохром- меченого нуклеотида – ПЦР-секвенирование с помощью создания библиотек ДНК-фрагментов (ПЦР в эмульсии) с помощью лигирования с помощью детекции встраивания единичного нуклеотида

Полимеразная цепная реакция Основана на принципе репликации ДНК Цикл ПЦР состоит из: 1. Денатурация мишени 2. Отжиг праймеров 3. Синтез новых цепей

Схема ПЦР

Виды ПЦР и области применения Секвенирование (cycle sequencing) Клонирование(cloning of gene/gene fragment into plasmid) Аллель-специфичная (polymorphism) In situ (infections and localization) PCR-ELISA (telomerase activity detection) RT-PCR (differential display) «В реальном времени» (reliable qualitative method) Гнездовая ПЦР (gene/transcript in single cell)

Дизайн праймеров для ПЦР Define sequence of interest Define method of detection (is labeling or introduction of non-complimentary sequences required? ) Download your sequence of interest into the software Check if sequence suggested by software accomplishes all your requirements Order from company specialized in oligos synthesis

Primer design software http: //www. ebi. ac. uk/biocat. html OR http: //www. chemie. uni-marburg. de/~becker/primgen. html OR http: //norp 5424 b. hsc. usc. edu/genetools. html General hints on primer design http: //alces. med. umn. edu/VGC. html Designing primers for cycle sequencing http: //www. biotech. iastate. edu/Facilities/DSSF/ Designing primers for detecting unknown sequences http: //www. blocks. fhcrc. org/blocks/help/CODEHOP OR http: //www. dartmouth. edu/artsci/bio/ambros/protocols/o ther/ koelle/degenerate_PCR. html

Primer design CODEHOP http: //blocks. fhcrc. org/blocks/codehop. html Degen. Designer ftp anonymous evolution. bchs. uh. edu Primer Design ftp anonymous ftp. chemie. unimarburg. de Primer-Master ftp anonymous ftp. ebi. ac. uk PRIMER-MIT ftp anonymous genome. wi. mit. edu Primers! ftp anonymous wuarchive. wustl. edu Primer Selection (VGC) http: //alces. med. umn. edu/vgc. html Primer Selection (USC) http: //norp 5424 b. hsc. usc. edu/genetools. html

Pwo Expand PCR Taq Pwo Expand PCR Taq Taq Pwo Expand PCR-variations: Long Template PCR 6. 3 kb 4. 8 kb 2. 9 kb 1. 1 kb Fragment length

Схема ПЦР с детекцией продукта «в реальном времени»

Схема ПЦР с интеркалирующим красителем

Генерация флуоресценции с помощью праймеров со «шпилькой» Один из специфичных праймеров несет на 5’-конце универсальную Zпоследовательность. В реакцию также добавляют универсальный праймер, 3’-конец которого соответствует Zпоследовательности, а 5’-конец образует в свободном состоянии шпилечную структуру. По концам шпильки расположены флуорофор и гаситель флуоресценции. Когда праймер находится в свободном состоянии, флуорофор и гаситель расположены рядом и флуоресценция отсутствует. Если же праймер встраивается в ДНК, при достраивании второй цепи на этапе элонгации шпилька разворачивается и появляется флуоресценция.

Схема ПЦР с пробами типа "молекулярный маячок" 5` и 3`-концы пробы комплементарны другу. Один из них помечен флуоресцентной меткой, а другой - тушителем флуоресценции. Такие пробы образуют структуру типа «петли на стебле» где зона комплиментарности пробы с матрицей находится в петле. При гибридизации пробы с матрицей вторичная структура разрушается, флуоресцентная метка и тушитель расходятся в разные стороны, и флуоресценция метки может быть детектирована.

ПЦР в реальном времени с использованием пробы Taq. Man В реакционную смесь добавляют ДНК-пробы, меченные на 5'-конце флуоресцентным красителем, а на 3'-конце — фосфатной группой и гасителем флуоресценции. Пробы комплементарны участку внутри амплифицируемой области. Гаситель поглощает испускаемое флуоресцентной меткой излучение, а фосфатная группа в 3'-положении блокирует полимеразу. При отжиге праймеров проба количественно связывается с комплементарным участком ДНК. Во время стадии элонгации полимераза синтезирует комплементарную цепь ДНК и, дойдя до участка, гибридизованного с пробой, начинает расщеплять пробу за счет 5'-экзонуклеазной активности. В результате флуоресцентная метка отделяется от гасителя, и увеличение флуоресценции будет прямо пропорционально количеству синтезированного ПЦР-продукта.

Определение специфичности сигнала: кривая плавления

Гибридизация на поверхности: оценка транскриптома

Гибридизация in situ для выявления хромосомных аберраций

Использование микроэлектроники в молекулярной диагностике Microfluidic PCR-CE device. Nano. Chip™ cartridge and electronic microarray. The latest generation Nano. Chip™ cartridge is used on the automated Molecular Biology Workstation developed by Nanogen. Each microarray has 100 test sites.

Целостная картина состояния организма