МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА профессор кафедры медицинской генетики В Н

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА профессор кафедры медицинской генетики В. Н. Горбунова

Фундаментальными свойствами живой природы, отличающими ее от неживой материи, являются способность к размножению и наследственность

Наследственность, обеспечивающая преемственность между поколениями, заключается в том, что особи любого вида рождают только себе подобных и их потомки, в среднем, более похожи на своих родственников, чем на других представителей того же вида

При этом каждый вид характеризуется определенным уровнем изменчивости, и даже братья и сестры никогда не являются точными копиями друга и своих родителей

Генетика – это наука о наследственности и изменчивости. Генетические исследования можно проводить на всех уровнях организации жизни от межвидового до молекулярного

Генетика популяций занимается изучением частот мутаций и генотипов в различных популяциях, а также факторов, влияющих на их динамику

Предметом генетики развития является генетический контроль эмбриогенеза, начиная с проэмбриональных стадий созревания половых клеток до завершения дифференцировки различных тканей и органов

Цитогенетика занимается изучением структуры и морфологии отдельных хромосом и их наборов в клетках, а также построением цитогенетических карт различных элементов генома

Биохимическая генетика исследует связи между генами и органическими соединениями, присутствующими в живых организмах

Целью молекулярной генетики является исследование материальной природы генов и генома в целом, а также тех процессов, которые происходят с нуклеиновыми кислотами в клетках

Как любая другая биологическая наука генетика состоит из общих и частных разделов. В частных разделах генетики исследуются особенности проявления общих закономерностей у разных видов организмов

Среди них ведущее положение занимает генетика человека, которая включает такие же разделы, как и общая генетика. Те ее направления, которые посвящены патологии человека, являются предметом медицинской генетики

Те разделы медицинской генетики, которые используются в клинической практике или имеют потенциальное значение для такого использования называются клинической генетикой

Среди них наиболее современным и перспективным направлением является молекулярная диагностика, основанная на анализе индивидуальных особенностей нуклеиновых кислот — ДНК и РНК

Эта методология широко используется во многих областях медицины, в первую очередь, для диагностики наследственных заболеваний независимо от их клинических проявлений и стадии развития организма

Молекулярная диагностика позволяет осуществлять поиск генетических факторов риска, предрасполагающих к развитию наиболее частых многофакторных заболеваний, к числу которых относятся более 90% всех болезней человека

Индивидуальный анализ генетических профилей нормальных и опухолевых тканей позволяет не только составлять прогнозы в отношении развития различных онкологических заболеваний, но и разрабатывать оптимальную стратегию их лечения

ДНК-диагностика любых биологических образцов является наиболее точным методом идентификации личности и используется в судебной медицине не только для поиска преступников, установления отцовства, но опознания останков погибших в результате войн, террористических актов и т. п.

ДНК-диагностика различных бактерий, грибков и вирусов имеет ряд преимуществ и в совокупности с традиционными методами значительно повышает точность и скорость диагностики инфекций и мониторинга применяемой терапии

В настоящее время фармакогенетика немыслима без использования молекулярной диагностики, которая позволяет разрабатывать индивидуальные схемы лечения в зависимости от генотипа больного

Одним из наиболее перспективных направлений современной фармакологии является поиск биомишеней для лекарственной терапии. В основе этого направления также лежит индивидуальный анализ ДНК

В настоящее время во всем мире прогресс в области лечения не только наследственных и многофакторных, но даже некоторых инфекционных заболеваний связывают с разработкой методов генной терапии, основанной на манипуляциях с различными молекулами ДНК

В дальнейшем мы подробно остановимся на каждом из этих направлений, но прежде всего мы вспомним основные положения классической генетики

1. Законы Менделя

Основополагающие законы наследования были открыты во второй половине XIX века Грегором Менделем и описаны в его знаменитой работе «Опыты над растительными гибридами» , вышедшей в 1865 г

Анализируя результаты скрещивания различных сортов гороха, различающихся по форме или окраске семян и цветков Мендель высказал гипотезу о существовании двух дискретных наследственных факторов, ответственных за каждый из исследуемых признаков

Один из этих факторов, названный Менделем доминантным (А) способен подавлять проявление другого фактора – рецессивного (а). Только один из этих факторов с равной вероятностью попадает в гаметы

В результате случайного оплодотворения образуются растения трех типов: АА, Аа и аа в соотношении 1: 2: 1

Поскольку рецессивный фактор не проявляется в присутствии доминантного, то в потомстве от скрещивания двух гибридных растений будут появляться растения, как с доминантным, так и с рецессивным признаком в соотношении 3: 1

Решетка Пеннета для моногибридного скрещивания Гаметы ♀/♂ А а А АА Аа аа

Почти через 40 лет В. Иогансен предложил назвать постулированные Менделем наследственные факторы генами

Варианты наследственных факторов или альтернативные состояния генов (А, а) носят названия аллелей Аллели влияют на характер развития признаков, что и служит основой для фенотипической изменчивости

Если фенотипическая изменчивость не выходит за пределы нормы, то аллели называют нормальными. Аллели, частоты которых в популяции превышают определенный уровень, называют полиморфными или полиморфизмами

Аллели, приводящие к патологическому развитию признака, называют мутантными аллелями или мутациями

Совокупность аллелей гена(ов) одного индивидуума называется генотипом, а совокупность признаков организма – фенотипом

Генотип может быть гомозиготным при наличии двух одинаковых аллелей (АА или аа) или гетерозиготным, если аллели разные (Аа)

Сочетания нормальных и мутантных аллелей всех генов человека определяют его индивидуальную наследственную конституцию. Таким образом, люди отличаются между собой не по наборам генов, а по их состояниям, то есть по наследственной конституции

Основным методом изучения наследования признаков у экспериментальных объектов является гибридологический анализ - система скрещиваний, позволяющая получать и анализировать гибриды

Гибридологический анализ не применим к человеку. Генеалогический анализ или анализ родословных дает нам возможность судить о том, является признак наследственным и подчиняется ли он законам Менделя

2. Хромосомная теория наследственности

На рубеже XIX и XX веков были изучены основные этапы деления клетки. Время жизни клетки с момента ее образования до деления составляет клеточный цикл, одной из важнейших стадий которого является митоз или собственно деление клетки

Ключевая роль в митозе принадлежит хромосомам – ядерным структурам, которые в период деления клетки отчетливо видны при световой микроскопии и использовании специфических методов окрашивания

В каждой хромосоме есть важный функциональный участок, который называется центромерой. Центромера разделяет хромосому на два плеча: короткое (p) и длинное (q). Конечные участки хромосом – теломеры – обеспечивают их структурную целостность

На синтетической стадии S клеточного цикла происходит удвоение каждой хромосомы с образованием двух сестринских хроматид, соединенных между собой одной центромерой

Окрашивающимся веществом хромосом является хроматин. Различные участки хромосом имеют неоднородную окраску. Более светлые районы хромосом называются эухроматином, а темные – гетерохроматином

В соматических клетках каждая хромосома представлена двумя копиями, то есть диплоидным набором В половых клетках набор хромосом одинарный или гаплоидный Это обеспечивается за счет особой формы деления половых клеток – мейоза

Прямые доказательства локализации генов в хромосомах были получены Т. Морганом (1910) в опытах на дрозофиле. Было показано, что гены расположены в хромосомах линейно

У человека 23 пары хромосом. У женщин обе хромосомы каждой пары гомологичны другу. У мужчин гомологичны только 22 пары хромосом – аутосомы

Оставшаяся пара у мужчин состоит из двух различных половых хромосом – X и Y, а у женщин – из двух гомологичных Х-хромосом. Нормальный кариотип женщины записывается как (46, ХХ), в мужчины – (46, ХY)

Методы дифференциального окрашивания хромосом позволяют идентифицировать не только каждую хромосому, но и отдельные районы хромосом, последовательно пронумерованные от центромеры к теломере, а также сегменты внутри районов

Во всех клетках женского организма одна из Ххромосом инактивирована. Это тельце Барра или половой гетерохроматин. Его идентификация является самым простым способом цитогенетической диагностики пола

В процессе мейоза происходит обмен между участками гомологичных хромосом – кроссинговер или гомологичная рекомбинация. Поэтому в каждом поколении появляются хромосомы, которые не являются точными копиями родительских хромосом, а составлены из их фрагментов

В начале ХХ века были получены прямые доказательства линейного расположения генов в хромосомах, причем мерой генетического расстояния служит вероятность рекомбинации между генами, измеряемая в сантиморганах (с. М)

Два гена одной хромосомы расположены друг от друга на расстоянии 1 с. М, если вероятность рекомбинации между ними в процессе мейоза составляет 1%

В результате развития хромосомной теории наследственности появилось представление о гене, как об участке хромосомы или хромосомном локусе, который отвечает за один признак и одновременно является единицей рекомбинации и мутации, ведущей к изменению фенотипа

Однако материальная природа гена оставалась неизвестной. Что представляет из себя загадочное вещество наследственности?

3. Наследственная информация и пути ее передачи

Хромосомы всех исследованных видов состоят из молекул ДНК и белков, большая часть из которых– до 80% – относится к специфическому классу гистонов

В середине 40 -х годов были получены доказательства того, что именно ДНК являются носителями генов или веществом наследственности

Определение пространственной организации ДНК явилось самым ярким открытием ХХ века. В 1953 г. Уотсон и Крик предложили модель, в соответствии с которой ДНК состоит из двух полимерных цепей, образующих форму двойной спирали

В основании каждой из полимерных цепей лежат последовательности из одинаковых сахаров – дезоксирибозы – соединенных между собой остатками фосфорной кислоты или фосфодиэфирной связью

Каждый сахар, в свою очередь, соединен гликозидной связью с одним из четырех азотистых оснований: двух пуринов – аденина (A) и гуанина (G), и двух пиримидинов – цитозина (C) и тимина (T)

Азотистое основание, сахар и остаток фосфорной кислоты вместе составляют нуклеотид. Таким образом, цепь ДНК представляет собой последовательность нуклеотидов

Структура нуклеотида

Две цепи ДНК удерживаются вместе за счет водородных связей между нуклеотидами. Аденин связывается с тимином, а гуанин с цитозином. Это правило – A-T, G-C называется правилом комплементарности

Длина ДНК измеряется в нуклеотидах или в парах оснований (п. о. ), тысячах п. о. – килобазах (кб) и миллионов п. о. – мегабазах (мб). У человека она составляет 3, 2 х109 п. о.

Основная масса ДНК находится в ядрах клеток в составе хромосом в суперскрученном состоянии за счет взаимодействия с гистонами. Около 1% ДНК находится в митохондриях

Таким образом, хромосомы – это форма упаковки ДНК в клетке. В процессе клеточного цикла длина хромосом меняется в 10 000 раз. В метафазе митоза хромосомы максимально спирализованы и располагаются в плоскости экватора клетки

Плотная упаковка хромосомы обеспечивается за счет образования хроматина. На этой основе формируются три универсальных уровня пространственной организации хроматина: нуклеосомный, нуклеомерный и хромомерный

Четыре пары гистонов образуют нуклеосому – основную структурную единицу хроматина, которая связывает ДНК длиной в 147 нуклеотидов. Затем нуклеосомы организуются в нуклеомеры и хромомеры, составляющие хроматиновые волокна

Три фундаментальных свойства отличают ДНК от всех других биологических молекул. Это кодирующая способность, способность к самовоспроизводству (репликация) и изменчивость

Кодирующая способность заключается в том, что в ДНК в виде последовательности нуклеотидов записана информация, определяющая разнообразие всех форм жизни. ДНК обеспечивает хранение этой информации, ее расшифровку и передачу в ряду поколений

Репликация ДНК осуществляется с помощью фермента ДНК-полимеразы, способного вести комплементарный синтез ДНК по однонитевой матрице

Наконец, варьирующий порядок нуклеотидов различных типов ДНК и их информационная ёмкость определяют как межвидовую, так и внутривидовую фенотипическую изменчивость

Недаром ДНК называют энциклопедией жизни Именно эта молекула определяет фундаментальные свойства жизни — способность к размножению, наследственность и изменчивость

Гены — эти те участки молекулы ДНК, которые содержат информацию о структуре других биологических молекул, прежде всего, различных классов рибонуклеиновых кислот (РНК) и белков.

Гены подобны бусинкам, которые на варьирующем и иногда значительном расстоянии друг от друга вкраплены в тончайшую нить ДНК

Подавляющее большинство генов человека имеют прерывистую структуру. Кодирующие участки генов — экзоны — перемежаются с некодирующими участками интронами

Открытие прерывистой структуры генов явилось самым неожиданным открытием ХХ века. Число и протяженность интронов прямо коррелирует со сложностью организации генов

Большинство генов человека кодируют белки, точнее полипептидные цепи - это белковые гены. Конечными продуктам около 25% генов являются молекулы РНК - это РНКовые гены

Расшифровка информации, закодированной в белковом гене, происходит в соответствии с центральной догмой молекулярной генетики: в клетке происходит направленный перенос генетической информации: ДНК – РНК – белок

Первым шагом на пути перехода от гена к полипептидной цепи является транскрипция – синтез с помощью фермента РНК-полимеразы молекул пре. РНК, комплементарных генам

Серия модификаций превращает пре. РНК в информационную или матричную РНК – м. РНК. При этом происходят изменения на концах молекулы, обеспечивающие стабилизацию м. РНК

Главной смысловой модификацией при процессинге м. РНК является сплайсинг, то есть избирательное вырезание интронов и сшивка экзонов с образованием м. РНК

Поскольку интроны, в среднем, значительно длиннее экзонов, молекулы м. РНК могут быть в десятки раз короче молекул пре. РНК

Зрелая м. РНК переходит в цитоплазму клетки и транслируется. Трансляция – это синтез полипептидной цепи по молекуле м. РНК. Трансляция происходит на рибосомах с помощью транспортных РНК (т. РНК)

Структура т. РНК

Любая т. РНК способна транспортировать одну аминокислоту, а какую именно – определяется структурой очень важного функционального участка т. РНК – антикодона

Таким образом, разные типы т. РНК в зависимости от структуры антикодона транспортируют разные аминокислоты

В месте контакта м. РНК с рибосомой, располагается кодирующий триплет или кодон. Его положение является сигналом приближения к комплексу м. РНК-рибосома той т. РНК, у которой антикодон комплементарен кодону

Это комплементарное взаимодействие и определяет специфичность присоединяемой аминокислоты Рибосома продвигается по м. РНК постепенно – «шажками» , продвигая м. РНК сквозь себя ровно на один

Таким образом, происходит специфический отбор аминокислот и их сшивка на рибосоме с образованием полипептидной цепи. Окончание синтеза кодируется любым из трех стоп- или нонсенс-кодонов

Итак, м. РНК – это последовательность нуклеотидов, полипептидная цепь – это последовательность аминокислот. По какому правилу происходит этот переход? Как называется этот центральный закон жизни?

Это генетический код – соответствие последовательности из трех нуклеотидов в м. РНК (кодона) определенной аминокислоте в полипептидной цепи, а значит и в белке

Триплетность и коллинеарность генетического кода

Свойства генетического кода • Триплетность – три нуклеотида соответствуют одной аминокислоте • Линейность – определяется линейным расположением кодонов в м. РНК • Неперекрываемость – каждый нуклеотид входит в состав своего кодона • Вырожденность – способность кодировать одну аминокислоту несколькими вариантами триплетов • Универсальность - генетический код одинаков для всего живого на Земле

Генетический код триплетен и составлен из четырех нуклеотидов. Число возможных сочетаний из четырех нуклеотидов по три в кодоне равно 64. Из них 3 соответствуют нонсенс-кодонам. Остальные варианты триплетов (61) кодируют 20 аминокислот

Это значит, что каждая аминокислота, за исключением метионина кодируется не одним, а несколькими вариантами триплетов – вырожденность генетического кода

Это значит, что каждая аминокислота, за исключением метионина кодируется не одним, а несколькими вариантами триплетов – вырожденность генетического кода

Универсальность генетического кода является бесспорным доказательством родственности всего живого на Земле

В результате развития молекулярной теории наследственности появилось представление о гене, как о транскрибируемом участке молекулы ДНК. Аллели являются вариантами нуклеотидной последовательности гена

В основе хранения и наследственной передачи генетической информации лежит матричный принцип

К матричным процессам наряду с транскрипцией и рекомбинацией относятся репликация, а также репарация – исправление ошибок, возникающих при репликации ДНК

5. Обратная генетика, генная инженерия

Открытие гена означает расшифровку аминокислотной последовательности кодируемого белка, что позволяет прогнозировать его структуру и функции, а также проводить иммунологический и биохимический анализ

Подобная методология «от гена к белку» называется обратной генетикой. Этот процесс сопровождается изоляцией и клонированием кодирующей области гена или «гена в пробирке» , то есть комплементарной ДНК (к. ДНК)

к. ДНК получается путем обратной транскрипции с использованием в качестве матрицы специфической м. РНК гена

При использовании в качестве матрицы м. РНК получают к. ДНК, состоящую только из экзонов, то есть представляющий собой кодирующую часть гена

Открытие гена означает не только получение «гена в пробирке» , но идентификацию первичного биохимического дефекта и первичной патологической метаболической цепи, а затем создание на этой базе предпосылок для разработки патогенетических методов лечения

Клонирование это эффективный метод поддержания и размножения любых относительно небольших молекул ДНК путем их встраивания в вектор и введения этой конструкции в бактериальные или другие клетки (клетки-хозяина)

ДНК, составленные из фрагментов различного происхождения, называются рекомбинантными. Клонирование к. ДНК позволяет увеличивать число копий гена путем размножения клеток-хозяина

Клонирование лежит в основе генной инженерии и, в частности, геноинженерного производства лекарственных препаратов

В качестве клонирующих векторов используют модифицированные плазмиды, фаги, вирусы и другие генетические конструкции. Размеры клонированных ДНК обычно составляют от нескольких сотен до тысяч нуклеотидов

Большей клонирующей способностью обладают космиды, объединяющие в себе преимущества плазмид и фагов. Для клонирования ДНК, содержащих целые гены, разработаны системы бактериальных и дрожжевых минихромосом

Искусственные хромосомы дрожжей (YAC) содержат в сочетании с плазмидной ДНК элементы воспроизводства дрожжей в клетках-хозяина. YAC-вектора способны удерживать фрагменты ДНК размером в сотни тысяч и даже миллионы п. о.

Методы генной инженерии in vivo позволяют конструировать модельные линии путем трансгеноза – искусственного введения чужеродной ДНК в оплодотворенную яйцеклетку или ранние зародыши экспериментальных объектов

Трансгенные линии животных являются идеальными экспериментальными системами для изучения функций отдельных генов и оценки их биологического действия на организм

Техника трансгеноза позволяет направленно разрушать гены ( «нокаут» -линии), вводить мутации в определенный ген, причем в одной или нескольких тканях и даже в определенный момент дифференцировки

Подобные модельные линии мышей сконструированы для всех известных генов наследственных болезней человека

Таким образом, созданы методические предпосылки для изучения биохимических основ первичных патологических нарушений и разработки адекватных методов их метаболической коррекции не только в системе in vitro, но и in vivo

5. Генетические основы развития

В дифференцированных клетках одновременно экспрессируются не более 20% генов. Наборы этих генов в разных типах клеток различны, что и определяет их специфику

Некоторые гены работают во всех клетках, обеспечивая энергетику, дыхание и другие жизненно важные процессы. Это – гены «домашнего хозяйства»

Однако большинство генов – тканеспецифические. Они экспрессируются только в определенных тканях в определенный момент их онтогенеза

Биохимические и молекулярные процессы, участвующие в контроле развития хорошо изучены. Однако до сих пор нет ответа на вопрос, как из одной оплодотворенной яйцеклетки образуется более 200 гистологических типов клеток, составляющих наш организм

Все клетки организма делятся на три группы – соматические, зародышевые и стволовые, найденные во многих тканях человека. В зависимости от внешних сигналов стволовые клетки могут дифференцироваться в различные специализированные типы клеток

Дифференцировка не сопровождается утратой генетического материала. Меняется лишь характер экспрессии генов. Дифференцированные клетки теряют тотипатентность, то есть способность давать начало любым другим типам клеток

Доказана ведущая роль цитоплазмы в детерминации развития. В ооците экспрессируются все гены, и в ооплазме накапливаются материнские белки и м. РНК, которые и управляют первыми этапами дробления зародыша – материнский эффект ооплазмы

В этот период происходит формирование строго упорядоченной гетерогенности ооплазмы, так называемая ооплазматическая сегрегация, в ходе которой закладывается план строения будущего организма.

Генетический контроль пространственной организации градиентов морфогенетически активных белков определяет сегментацию организма, и он универсален в животном мире

В зрелых ооцитах транскрипция не обнаруживается. Она восстанавливается только на стадии зиготы, когда наблюдается прогрессивная активация или репрограммирование эмбрионального генома

Дальнейшая дифференцировка и морфогенез осуществляется под контролем транскрипционных факторов – секреторных молекул, способных взаимодействовать с регуляторными участками других генов, так называемой «генной» сети

Транскрипционные факторы образуют концентрационные градиенты, которые, в свою очередь, включают и выключают каскады других генов. Затем этот процесс повторяется в более узких масштабах. В результате в каждом сегменте тела складывается своя характерная комбинация активных генов

Тело взрослого организма формируется как "лоскутное одеяло". В каждом лоскуте экспрессируется определенный набор генов

При этом ядра, а значит и ДНК, не утрачивают свойство тотипатентности и, будучи трансплантированы в безъядерную зиготу, способны инициировать развитие, что убедительно показано в опытах по клонированию животных

В 1997 г. появилось сенсационное сообщение о получении клонального животного – овечки Долли

В этих экспериментах, выполненных под руководством Яна Вильмута, донорские ядра из клеток молочной железы овцы трансплантировали в ее же ооциты. Из 277 ооцитов, подвергшихся трансплантации, родилась только одна Долли

Схема опытов Яна Вильмута

В настоящее время работы в области репродуктивного клонирования человека, то есть получения нового организма из соматической клетки реципиента, считаются недопустимыми. Это связано с большим количеством этических и правовых проблем

Более перспективным представляется терапевтическое клонирование, то есть выращивание из стволовых клеток специализированных тканей. При этом может быть снята одна из самых серьёзных проблем трансплантологии– отторжение пересаженных тканей