Скачать презентацию Молекулярная диагностика Молекулярно-генетические методы в медицинской практике Скачать презентацию Молекулярная диагностика Молекулярно-генетические методы в медицинской практике

Для Мечникова.ppt

  • Количество слайдов: 119

Молекулярная диагностика Молекулярно-генетические методы в медицинской практике Молекулярная диагностика Молекулярно-генетические методы в медицинской практике

Где применяется n Диагностика инфекционных заболеваний n Диагностика моногенных наследственных болезней n n Судебно-медицинская Где применяется n Диагностика инфекционных заболеваний n Диагностика моногенных наследственных болезней n n Судебно-медицинская экспертиза Анализ генетической предрасположенности

Разрабатываются подходы n Фармакогенетика n Онкогенетика n n Генотерапия Генетика мультифакториальных заболеваний Разрабатываются подходы n Фармакогенетика n Онкогенетика n n Генотерапия Генетика мультифакториальных заболеваний

ПРЕДМЕТ ИССЛЕДОВАНИЯ различия в первичной структуре ДНК cgggg cgcacagagc ca g aggggct tgcgagcggc ggctgaggga ПРЕДМЕТ ИССЛЕДОВАНИЯ различия в первичной структуре ДНК cgggg cgcacagagc ca g aggggct tgcgagcggc ggctgaggga ccgcggggag cgggg cgcacagagc ca с aggggct tgcgagcggc ggctgaggga ccgcggggag Мутация (полиморфизм)

Молекула ДНК Молекула ДНК

Генные мутации и полиморфизм ДНК Сходства - по своей природе одинаковы - могут быть Генные мутации и полиморфизм ДНК Сходства - по своей природе одинаковы - могут быть как нейтральными, так и оказывающими влияние на жизнедеятельность Отличия - мутации редки (до 3%) - полиморфизм чаще (свыше 3%)

Генные мутации и полиморфизм 2 Точковые (замены, инсерции, делеции) n Структурные (инверсии, инсерции, делеции) Генные мутации и полиморфизм 2 Точковые (замены, инсерции, делеции) n Структурные (инверсии, инсерции, делеции) n Полиморфизм повторяющихся элементов ДНК, динамические мутации n

Повторяющиеся последовательности генома n Рассеянные некодирующие повторы транспозоны, эндогенные ретровирусы n Кодирующие последовательности мультигенные Повторяющиеся последовательности генома n Рассеянные некодирующие повторы транспозоны, эндогенные ретровирусы n Кодирующие последовательности мультигенные семейства, рассеянные семейства, псевдогены n Тандемные повторы кодирующие и некодирующие

Что такое тандемные повторы Динуклеотидный CG повтор gaccga. CGCGCGccagtc – (CG)6 gaccga. CGCGCGCGccagtc – Что такое тандемные повторы Динуклеотидный CG повтор gaccga. CGCGCGccagtc – (CG)6 gaccga. CGCGCGCGccagtc – (CG)7 gaccga. CGCGCGCGccagtc – (CG)8

Тандемные повторы Микросателлиты (2 -13 п. н. ) n Минисателлиты (до 64 п. н. Тандемные повторы Микросателлиты (2 -13 п. н. ) n Минисателлиты (до 64 п. н. ) n Сателлиты (до 171 п. н. ) n Мегасателлиты (до неск. тысяч п. н. ) n

Методы молекулярной диагностики Блот-гибридизация n ПЦР n ЛЦР n ASO (метод аллель-специфических олигонуклеотидов n Методы молекулярной диагностики Блот-гибридизация n ПЦР n ЛЦР n ASO (метод аллель-специфических олигонуклеотидов n Real-time ПЦР (ПЦР в реальном времени) n И многое другое

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) Предложена в 1983 г. K. Mullis (Нобелевская премия 1989 г. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) Предложена в 1983 г. K. Mullis (Нобелевская премия 1989 г. ) Позволяет получить in vitro большое число идентичных копий специфических нуклеотидных последовательностей

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) Необходимы: - ДНК-мишень (80 – 1000 пн) - Специфические олигонуклеотидные Полимеразная цепная реакция (ПЦР) Необходимы: - ДНК-мишень (80 – 1000 пн) - Специфические олигонуклеотидные праймеры - ДНК-полимераза Taq или Tth (из Thermus aquaticus или T. Thermopilus) - Дезоксирибонуклеоидтрифосфаты

ПЦР – выбор праймеров 5’ 3’ 5’ ПЦР – выбор праймеров 5’ 3’ 5’

ПЦР – выбор праймеров 5’cgggg cgcacagagc cagaggggct tgcgagcggc ggctgaggga ccgcggggag ggggcgccga gcggctccag cgcagagact ctcactgcac ПЦР – выбор праймеров 5’cgggg cgcacagagc cagaggggct tgcgagcggc ggctgaggga ccgcggggag ggggcgccga gcggctccag cgcagagact ctcactgcac gccggagggc gcccttcctc gctcgcgccc gcgcgaccgc gcgccccagt cccgctaacc gccccagaca cagcgctcgc cgagggtcgc ttggaccctg atcttacccg tgggcaccct 3’ n n Прямой праймер: 5’ cgcacagagccagaggggct -3’ Обратный праймер: 5’ cagggtccaagcgaccctcg -3’

ПЦР – начало 92ºС 55ºС ПЦР – начало 92ºС 55ºС

ПЦР - 2 72º 92º ПЦР - 2 72º 92º

ПЦР - 3 Результат ПЦР - 3 Результат

Электрофорез Камера для агарозного электрофореза Электрофорез Камера для агарозного электрофореза

ВИЗУАЛИЗАЦИЯ И РАЗДЕЛЕНИЕ ПРОДУКТОВ ПЦР С ПОМОЩЬЮ ГЕЛЬ-ЭЛЕКТРОФОРЕЗА ВИЗУАЛИЗАЦИЯ И РАЗДЕЛЕНИЕ ПРОДУКТОВ ПЦР С ПОМОЩЬЮ ГЕЛЬ-ЭЛЕКТРОФОРЕЗА

БОЛЬШИЕ ДЕЛЕЦИИ БОЛЬШИЕ ДЕЛЕЦИИ

Маленькие делеции Маленькие делеции

Инсерция Alu-элемента Инсерция Делеция Инсерция Alu-элемента Инсерция Делеция

Принцип ПДРФ-анализа (полиморфизм длины рестрикционных фрагментов) Рестриктаза Hinf 1 - последовательность GAGTC Полиморфизм MTHFR Принцип ПДРФ-анализа (полиморфизм длины рестрикционных фрагментов) Рестриктаза Hinf 1 - последовательность GAGTC Полиморфизм MTHFR C 677 T Вариант С – GAGCC (не узнается) Вариант Т – GAGTC (узнается)

ПДРФ анализ ПЦР Электрофорез Рестрикция (проверка ПЦР) Электрофорез (анализ) а) схема рестрикции. Сайт для ПДРФ анализ ПЦР Электрофорез Рестрикция (проверка ПЦР) Электрофорез (анализ) а) схема рестрикции. Сайт для рестриктазы gag. Тc С аллель Т аллель Hinf I сайт б) анализ результатов СС СТ ТТ

ТАНДЕМНЫЕ ПОВТОРЫ Для 4 хнуклеотидных повторов: Если 13 повторов – 100 п. н, 14 ТАНДЕМНЫЕ ПОВТОРЫ Для 4 хнуклеотидных повторов: Если 13 повторов – 100 п. н, 14 повторов – 104 п. н. , 15 повторов – 108 п. н. И т. д.

СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА SNP ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ МАССПЕКТРОМЕТРИЯ БИОЧИПЫ ПОЛНОГЕНОМНОЕ СЕКВЕНИРОВАНИЕ СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА SNP ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ МАССПЕКТРОМЕТРИЯ БИОЧИПЫ ПОЛНОГЕНОМНОЕ СЕКВЕНИРОВАНИЕ

Hydrolysis (Taq. Man) Hydrolysis (Taq. Man)

Масс-спектроскопия Масс-спектрометрия - это физический метод измерения отношения массы заряженных частиц материи (ионов) к Масс-спектроскопия Масс-спектрометрия - это физический метод измерения отношения массы заряженных частиц материи (ионов) к их заряду. Масс-спектр - это просто рассортировка заряженных частиц по их массам (точнее отношениям массы к заряду). Основные этапы: n. Ионизация n. Рассортировка по массе n. Детекция

- Биочип - упорядоченная матрица ячеек, каждая из которых содержит молекулярный зонд (ДНК, РНК, - Биочип - упорядоченная матрица ячеек, каждая из которых содержит молекулярный зонд (ДНК, РНК, белки, клетки) - Биочип способен осуществлять одновременный множественный анализ биологических объектов в исследуемом образце (каждая ячейка – индивидуальная реакционная пробирка) - ДНК-биочипы представляют собой зонды, способные не только выявлять наличие определенной ДНК в образце, то и находить в ней фенотипически значимые мутации – полиморфизмы, что позволяет диагностировать наследственные заболевания, определять генетическую предрасположенность к мультифакторным болезням, чувствительность к фармпрепаратам, лекарственную устойчивость у бактерий и т. д. )

ТЕХНОЛОГИЯ БИОЧИПОВ биочип Портативный анализатор робот Автоматический анализ генетических изменений (до 100 образцов в ТЕХНОЛОГИЯ БИОЧИПОВ биочип Портативный анализатор робот Автоматический анализ генетических изменений (до 100 образцов в день)

ПРИНЦИП ДЕТЕКЦИИ МУТАЦИЙ С ПОМОЩЬЮ БИОЧИПА 5’ Гибридизация одноцепочечного меченого продукта с иммобилизованными на ПРИНЦИП ДЕТЕКЦИИ МУТАЦИЙ С ПОМОЩЬЮ БИОЧИПА 5’ Гибридизация одноцепочечного меченого продукта с иммобилизованными на биочипе олигонуклеотидами G 3’ A N N NNNNNNN C NNNNNNNN G NNNN NNNN C NNNN или _ _ _ NNNN C NNNN Детекция флуоресцентного сигнала и анализ полученного изображения Сигнал флуоресценции Отсутствие флуоресценции

ВЫСОКОВОСПРОИЗВОДИТЕЛЬНЫЕ ГЕНОМНЫЕ СЕКВЕНАТОРЫ ДЛЯ «ОБЫЧНОЙ» ПЦР-ЛАБОРАТОРИИ Ion Torren – геномный GS Junior – геномный ВЫСОКОВОСПРОИЗВОДИТЕЛЬНЫЕ ГЕНОМНЫЕ СЕКВЕНАТОРЫ ДЛЯ «ОБЫЧНОЙ» ПЦР-ЛАБОРАТОРИИ Ion Torren – геномный GS Junior – геномный секвенатор, в основе которого секвенатор, на основе технологии лежит эффект пирофосфатного секвенирования полупроводниковой платформы

Гены кардиомиопатий Гены Символ Хромосома Частота Основные гены β-Myosin heavy chain Myosin binding protein-C Гены кардиомиопатий Гены Символ Хромосома Частота Основные гены β-Myosin heavy chain Myosin binding protein-C Cardiac troponin T Cardiac troponin I α-Tropomyosin Myozenin 2 Myosin light chain 1 Myosin light chain 2 α-Cardiac actin Titin Telethonin MYH 7 MYBPC 3 TNNT 2 TNNI 3 TPM 1 MYOZ 2 MYL 3 MYL 2 ACTC 1 TTN TCAP 14 q 1 11 q 1 1 q 3 19 p 13. 2 15 q 1 4 q 25– 26 3 p 12 q 15 q 11 2 q 13– 33 17 q 12 ~25– 30% ~3– 5% ~1% 1 : 250 Rare Rare Вероятные гены-кандидаты Myosin light chain kinase 2 α-Myosin heavy chain Cardiac troponin C Caveolin 3 Phospholamban Calreticulin Junctophilin-2 Mitochondrial t. RNAs MYLK 2 20 q 13. 3 MYH 6 14 q 12 TNNC 1 3 p 21 CAV 3 3 p 25 PLN 6 p 22. 1 CALR 3 19 p 13. 11 JPH 2 20 q 13. 12 MTTG, MTTI Mitochondrial DNA Marian, Необходимость секвенирования 2008 Rare Rare http: //www. zoonoz. ru/348. php

Исследование генов кардиомиопатий методом NGS секвенирования Гены кардиомиопатий: ACTC 1 MYBPC 3 MYH 7 Исследование генов кардиомиопатий методом NGS секвенирования Гены кардиомиопатий: ACTC 1 MYBPC 3 MYH 7 MYL 2 MYL 3 TNNI 3 TNNT 2 TPM 1 CASQ 2 Одновременные анализ 9 генов (более 2000 мутаций) Стоимость исследования всего 1500$ (старыми методами – более 10000$ за секвенирование 1 гена)

HLA-типирование Строение области HLA (Human Leukocyte Antigen) n HLA – поверхностный антиген B- и HLA-типирование Строение области HLA (Human Leukocyte Antigen) n HLA – поверхностный антиген B- и T-лимфоцитов (главный комплекс гистосовместимости) n HLA наиболее полиморфная область человеческого генома n В октябре 2010 году было обнаружено порядка 5674 аллелей этой области n Постоянно обнаруживаются новые варианты Chromosome 6 HLA Gene DP DM B 1 A 1 B A 150 kb TAP DQ 1 2 50 kb DR B 1 A 1 200 kb TNF B 1 B 3 A 1 B 4 B 5 50 kb class II loci *source: E. Thorsby, Human Immunol. , 53, 1 -11, 1997 B A B 850 kb 250 kb C 100 kb A 1270 kb class I loci

МОНОГЕННЫЕ НАСЛЕДСТВЕННЫЕ БОЛЕЗНИ МОНОГЕННЫЕ НАСЛЕДСТВЕННЫЕ БОЛЕЗНИ

Моногенные наследственные заболевания Всего известно до 4000 болезней n Частота до 0, 5% среди Моногенные наследственные заболевания Всего известно до 4000 болезней n Частота до 0, 5% среди новорожденных n Различные сроки манифестации у новороженных 25% n до 3 лет 70% до пубертата 90% n Часто встречаются изолированные случаи аутосомно-рецессивные заболевания, мутации de novo

Патогенез некоторых наследственных заболеваний Гемофилия А – дефицит FVIII n Миопатия Дюшенна – отсутствие Патогенез некоторых наследственных заболеваний Гемофилия А – дефицит FVIII n Миопатия Дюшенна – отсутствие белка, стабилизирующего клеточную мембрану миоцитов n ФКУ – отсутствие фенилаланингидроксилазы n СМА – отсутствие белка, тормозящего апоптоз в моторных нейронах передних рогов спинного мозга n

Частоты заболеваний Частые (более чем 1: 10 000 населения) n Средняя частота (от 1: Частоты заболеваний Частые (более чем 1: 10 000 населения) n Средняя частота (от 1: 10 000 до 1: 40 000) n Редкие (менее чем 1: 40 000) n

Распространенные наследственные болезни По всему миру Адрено-генитальный синдром Спинальная амиотрофия Верднига-Гофмана Миодистрофия Дюшенна Гемофилия Распространенные наследственные болезни По всему миру Адрено-генитальный синдром Спинальная амиотрофия Верднига-Гофмана Миодистрофия Дюшенна Гемофилия А Нейрофиброматоз В России Муковисцидоз Фенилкетонурия Адрено-генитальный синдром Спинальная амиотрофия Верднига-Гофмана

Частота адрено-генитального синдрома в разных популяциях Швейцария, кантон Цюрих 1: 5 000 n Кувейт Частота адрено-генитального синдрома в разных популяциях Швейцария, кантон Цюрих 1: 5 000 n Кувейт 1: 9 000 n Швеция 1: 11 500 n Япония 1: 18 000 n

Частота встречаемости фенилкетонурии в различных популяциях Турция, Ирландия 1: 2 600 новорожденных Япония 1: Частота встречаемости фенилкетонурии в различных популяциях Турция, Ирландия 1: 2 600 новорожденных Япония 1: 120 000 новорожденных Европа 1: 10 000 новорожденных Финляндия 5: 4 500 000 населения

Частоты носительства Каждый человек имеет около 10 мутаций, летальных в гомозиготном состоянии Частоты носительства Каждый человек имеет около 10 мутаций, летальных в гомозиготном состоянии

Частота гетерозиготного носительства МВ Уравнение Харди-Вайнберга p²+2 pq+q² Пусть q²=1/3600. Тогда q=1/60. 2 pq=2*59/60*1/60=1/30 Частота гетерозиготного носительства МВ Уравнение Харди-Вайнберга p²+2 pq+q² Пусть q²=1/3600. Тогда q=1/60. 2 pq=2*59/60*1/60=1/30

Два подхода к молекулярной диагностике НБ n Прямая диагностика – поиск мутаций, приводящих к Два подхода к молекулярной диагностике НБ n Прямая диагностика – поиск мутаций, приводящих к развитию болезни n Косвенная диагностика – выявление мутантных аллелей без установления природы конкретных мутаций, путем анализа внутригенных полиморфных локусов в данной семье

Косвенная диагностика Появилась значительно раньше Косвенная диагностика Появилась значительно раньше

Недостатки косвенной диагностики Возможна только при проведении семейного анализа и наличии материала пробанда n Недостатки косвенной диагностики Возможна только при проведении семейного анализа и наличии материала пробанда n Необходимо наличие информативности семьи n Меньшая точность всвязи с вероятностью кроссинговера между маркером и мутацией n

Косвенная диагностика возможности n Возможны пренатальная диагностика, определение носительства, пресимптоматическая и преимплантационная диагностика n Косвенная диагностика возможности n Возможны пренатальная диагностика, определение носительства, пресимптоматическая и преимплантационная диагностика n Невозможна верификация диагноза

Прямая диагностика – выявление мутаций в конкретной семье Позволяет решать ВСЕ задачи молекулярной диагностики Прямая диагностика – выявление мутаций в конкретной семье Позволяет решать ВСЕ задачи молекулярной диагностики

Мажорные мутации – более 1% всех мутаций при данном заболевании Существуют для большинства распространенных Мажорные мутации – более 1% всех мутаций при данном заболевании Существуют для большинства распространенных НБ МВ – 70% ФКУ – 60% МДД – 70% СМА – 98% ХГ – 99%

Мажорные мутации при МВ наиболее частых) В Европе (всего 55 мажорных мутаций) del. F Мажорные мутации при МВ наиболее частых) В Европе (всего 55 мажорных мутаций) del. F 508 - 66, 8% (26, 387, 2%) G 542 X – 2, 6% N 1303 K – 1, 6% G 551 D – 1, 5% W 1282 X – 1, 0% (5 В России (всего 19 мажорных мутаций) del. F 508 – 50, 2% 3737 del. A – 4, 3% Del 21 kb – 4, 1% 2143 del. T – 3, 2% 2184 ins. A – 2, 7%

Большие делеции – мажорные мутации при миопатии Дюшенна Большие делеции – мажорные мутации при миопатии Дюшенна

Пренатальная диагностика муковисцидоза (прямой метод, del. F 508) Пренатальная диагностика муковисцидоза (прямой метод, del. F 508)

Прямая диагностика 3 При отсутствии мажорных мутаций возможен поиск мутаций в конкретной семье (секвенирование Прямая диагностика 3 При отсутствии мажорных мутаций возможен поиск мутаций в конкретной семье (секвенирование гена) n Применяется редко – высокая трудоемкость и стоимость n

Алгоритм пренатальной диагностики моногенных болезней Правильный клинический диагноз проводится до беременности ДНК диагностика семьи Алгоритм пренатальной диагностики моногенных болезней Правильный клинический диагноз проводится до беременности ДНК диагностика семьи Оценка риска заболевания низкий риск Пренатальная диагностика не проводится высокий риск Проведение пренатальной диагностики Материал плода Лабораторное исследование БИОХИМИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА Ферменты, другие белки; Продукты метаболизма Прямой метод; Непрямой (косвенный) метод !!!

Задачи ДНКдиагностики Задачи ДНКдиагностики

1. Подтверждение клинического диагноза, дифференциальная диагностика Клиническая картина заболевания может весьма отличаться по симптомам, 1. Подтверждение клинического диагноза, дифференциальная диагностика Клиническая картина заболевания может весьма отличаться по симптомам, тяжести течения. Возможны разные типы наследования

2. ПРЕНАТАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА Доступна с 9 -10 недель беременности Материал: хорион, плацента, амниоциты, пуповинная 2. ПРЕНАТАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА Доступна с 9 -10 недель беременности Материал: хорион, плацента, амниоциты, пуповинная кровь

3. Пресимптоматическая диагностика Хорея Гентингтона n Миотоническая дистрофия Болезнь Альцгеймера (семейные формы) n n 3. Пресимптоматическая диагностика Хорея Гентингтона n Миотоническая дистрофия Болезнь Альцгеймера (семейные формы) n n n Начало в среднем в 3 м 10 летии жизни Инвалидизация, гибель через 10 -15 лет Лечения на настоящий момент не существует

Пресимптоматическая диагностика проводится На основе принципа информированного согласия n Добровольно n Только совершеннолетним при Пресимптоматическая диагностика проводится На основе принципа информированного согласия n Добровольно n Только совершеннолетним при личном обращении n Результаты конфиденциальны n

4. Выявление гетерозиготного носительства, прогноз риска Кому нужно n Семьям, имеющим больных детей n 4. Выявление гетерозиготного носительства, прогноз риска Кому нужно n Семьям, имеющим больных детей n Семьям, имеющим больных родственников n Родителям больных детей в повторном браке n Кровным родственникам, вступающим в брак n Всем желающим

5. Преимплантационная диагностика 5. Преимплантационная диагностика

Принципиальная схема предимплантационной диагностики генных болезней Лизирование ПЦР Иващенко, 2011 Принципиальная схема предимплантационной диагностики генных болезней Лизирование ПЦР Иващенко, 2011

6. Неинвазивная диагностика Использует клетки плода или ДНК плода, циркулирующие в крови матери n 6. Неинвазивная диагностика Использует клетки плода или ДНК плода, циркулирующие в крови матери n Доступно с 7 й недели беременности n Можно определить: - пол - резус-фактор - мутации, отсутствующие у матери n

Где проводится молекулярная диагностика Россия Федеральные центры Западная Европа - Лаборатория ДНК-диагностики Около 300 Где проводится молекулярная диагностика Россия Федеральные центры Западная Европа - Лаборатория ДНК-диагностики Около 300 лабораторий Более 400 заболеваний - Каталог лабораторий www. eddnal. com - - Медико-генетического научного центра, Москва Лаборатория пренатальной диагностики ИАГ РАМН, СПб Лаборатория молекулярной генетики ИМГ, Томск Уфимский научный центр РАН, г. Уфа Лаборатория ДНК-диагностики, г. Новосибирск

Фенотип - продукт взаимодействия продуктов генов и окружающей среды Внешняя среда Гены Фенотип - продукт взаимодействия продуктов генов и окружающей среды Внешняя среда Гены

Заболевания органов дыхания (бронхиальная астма, хронический бронхит) Заболевания костной и соединительной тканей (остеопороз, артроз) Заболевания органов дыхания (бронхиальная астма, хронический бронхит) Заболевания костной и соединительной тканей (остеопороз, артроз) Мультифакториальные заболевания Акушерско-гинекологические патологии (эндометриоз, гестоз, привычное невынашивание, плацентарная недостаточность) Сердечно-сосудистые патологии (первичная гипертоническая болезнь у детей )

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ИНДИВИДУАЛЬНОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К МУЛЬТИФАКТОРИАЛЬНЫМ БОЛЕЗНЯМ ГЕННАЯ СЕТЬ. ДОЛЯ РАЗНЫХ ГЕНОВ В ПАТОГЕНЕЗЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ИНДИВИДУАЛЬНОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К МУЛЬТИФАКТОРИАЛЬНЫМ БОЛЕЗНЯМ ГЕННАЯ СЕТЬ. ДОЛЯ РАЗНЫХ ГЕНОВ В ПАТОГЕНЕЗЕ gene 1 gene 2 gene 3 gene 4 gene 5 ------- gene 6 РИСК ИНДИВИДУАЛЬНОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ВНЕШНИЕ ФАКТОРЫ (СПОРТ и др. ) Инд. 1 Инд. 2 Инд. 3 Инд. 44

Published Genome-Wide Associations through 3/2010, 779 published GWA at p<5 x 10 -8 for Published Genome-Wide Associations through 3/2010, 779 published GWA at p<5 x 10 -8 for 148 traits NHGRI GWA Catalog www. genome. gov/GWAStudies

ГЕНЫ «ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ» мутантные гены (аллели), совместимые с анте- и постнатальной жизнью человека, приводящие в ГЕНЫ «ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ» мутантные гены (аллели), совместимые с анте- и постнатальной жизнью человека, приводящие в неблагоприятных условиях к различным заболеваниям. - Гены системы детоксикации - Гены рецепторы - Гены метаболические шунты - Гены «старения» - Гены иммунной защиты - Генные сети мультифакториальных заболеваний

Бронхиальная астма коллекция - 140 образцов (ДНК и фильтры ) Изучаемые гены и полиморфизмы Бронхиальная астма коллекция - 140 образцов (ДНК и фильтры ) Изучаемые гены и полиморфизмы Научные находки Распределение генотипов GSTT 1 и GSTM 1 в контрольной группе и у пациентов БА. 50% 45% 40% 47% 49% 35% 30% 25% 20% 33%30% 15% 10% 5% 0% 12% GSTM 10/0 GSTM 1 0/0 GSTT 1+ 8% 9% GSTM 1+ GSTT 10/0 12% GSTM 1+ GSTT 1+

Остеопороз Научные находки коллекция - 290 образцов (ДНК) Изучаемые гены и полиморфизмы Частоты генотипов Остеопороз Научные находки коллекция - 290 образцов (ДНК) Изучаемые гены и полиморфизмы Частоты генотипов по генам Col 1 a 1 и VDR в группе пациенток с медленной ( ) и быстрой потерей МПК ( ) 95, 9 79, 6 73, 3 52, 0 % 29, 3 16, 3 12, 0 Гены КСШ (OR) VDR 7, 6 14, 7 4, 1 18, 7 0, 0 Col 1 a 1 24

Частоты «мутантных» аллелей изученных генов у больных артериальной гипертензией и в контроле мальчики * Частоты «мутантных» аллелей изученных генов у больных артериальной гипертензией и в контроле мальчики * p=0. 03 * р=0. 05 девочки

Частоты «мутантных» аллелей изученных генов у детей, больных артериальной гипертензией (в различных подгруппах) * Частоты «мутантных» аллелей изученных генов у детей, больных артериальной гипертензией (в различных подгруппах) * p=0. 003 * p=0. 02 * р=0. 05

ГЕНЫ, АССОЦИИРОВАННЫЕ С РИСКОМ РАЗВИТИЯ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ BRCA 1 BRCA 2 CHEK 2 ГЕНЫ, АССОЦИИРОВАННЫЕ С РИСКОМ РАЗВИТИЯ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ BRCA 1 BRCA 2 CHEK 2 Риск в течении жизни BC - 60 -85%, OC - 15 -60% BC - 50 -80%, OC - 10 -20% Риск возрастает в 2 раза >340 мутаций >10 мутаций 185 del. AG 300 T>G 4153 del. A 4158 A>G 5382 ins. C 6174 del. T 695 ins. С 1100 del. C

ХРОМОСОМНЫЕ ТРАНСЛОКАЦИИ ПРИ ЛЕЙКОЗАХ В 40 - 50% случаев доказанной причиной развития заболевания являются ХРОМОСОМНЫЕ ТРАНСЛОКАЦИИ ПРИ ЛЕЙКОЗАХ В 40 - 50% случаев доказанной причиной развития заболевания являются неслучайные хромосомные перестройки Ген 1 Ген 2 Химерный ген Химерный онкобелок Вызывает неограниченный рост клеток и блокирует созревание Известно более 50 различных хромосомных перестроек

БИОЧИП ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ЛЕЙКОЗОВ Нормальный образец. Светятся только контрольные ячейки. Острый промиелоцитарный лейкоз t(15; БИОЧИП ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ЛЕЙКОЗОВ Нормальный образец. Светятся только контрольные ячейки. Острый промиелоцитарный лейкоз t(15; 17) PML/RARa Терапия ретиноевой кислотой. Излечивается около 95% Острый лимфобластный лейкоз t(4; 11) MLL/AF 4 Лечение высокими дозами химиопрепаратов. Без трансплантации костного мозга выживаемость 5 -10%

ФАРМАКОГЕНЕТИКА ФАРМАКОГЕНЕТИКА

ЛС неэффективны у 10 -40% пациентов n В США ежегодно умирает 100 000 и ЛС неэффективны у 10 -40% пациентов n В США ежегодно умирает 100 000 и более 2 млн госпитализируются по поводу нежелательных лекарственных реакций. n

Причины межиндивидуальных различий фармакологического ответа n n n возраст пол функциональное состояние органов и Причины межиндивидуальных различий фармакологического ответа n n n возраст пол функциональное состояние органов и систем (ЖКТ, печени, почек, крови и др. ) этиология и характер течения заболевания сопутствующая терапия (в т. ч. медикаментозная) генетические различия (20 -95% всех неблагоприятных ответов)

ФЕНОТИПИРОВАНИЕ И ГЕНОТИПИРОВАНИЕ НЕДОСТАТКИ: ПРЕИМУЩЕСТВА: -нежелательные реакции -не нужно применять ЛС -инвазивность -проводится 1 ФЕНОТИПИРОВАНИЕ И ГЕНОТИПИРОВАНИЕ НЕДОСТАТКИ: ПРЕИМУЩЕСТВА: -нежелательные реакции -не нужно применять ЛС -инвазивность -проводится 1 раз -периодичность и плавающие показатели -не изменяется во времени -нескрининговые методы -скрининг возможен

ФАРМАКОГЕНЕТИКА Первые данные: Примахин – гемолиз эритроцитов – глюкозо-6 фосфат-дегидрогеназа (1956) Сукцинилхолин – остановка ФАРМАКОГЕНЕТИКА Первые данные: Примахин – гемолиз эритроцитов – глюкозо-6 фосфат-дегидрогеназа (1956) Сукцинилхолин – остановка дыхания псевдохолинэстераза (1957) Изониазид – побочные реакции – Nацетилтрансфераза (1957) Термин предложен в 1959 г. F. Vogel

Главные причины фармакогенетических различий: Полиморфизм генов, контролирующих: n метаболизм лекарственных средств n Транспортные системы Главные причины фармакогенетических различий: Полиморфизм генов, контролирующих: n метаболизм лекарственных средств n Транспортные системы лекарств n Молекулярные точки приложения лекарств (мишени)

ОСНОВНЫЕ ФАЗЫ ДЕТОКСИКАЦИИ ФАЗА I ЦИТОХРОМЫ P 450, ЭЕПОКСИ ДГИДРОЛАЗЫ И ДР. ЛЕКАРСТВА, ПИЩА. ОСНОВНЫЕ ФАЗЫ ДЕТОКСИКАЦИИ ФАЗА I ЦИТОХРОМЫ P 450, ЭЕПОКСИ ДГИДРОЛАЗЫ И ДР. ЛЕКАРСТВА, ПИЩА. КАНЦЕРОГЕНЫ, ЗАГРЯЗНЕНИЕ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ ФАЗА II ГЛЮТАТИОНТРАНСФЕРАЗЫ, N- АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗЫ, UDF-ГЛЮКОРОНСУЛЬФОТРАНСФЕРАЗЫ И ДР. АКТИВАЦИЯ КСЕНОБИОТИКОВ С ОБРАЗОВАНИЕМ АКТИВНЫХ ПРОМЕЖУТОЧНЫХ ЭЛЕКТРОФИЛЬНЫХ МЕТАБОЛИТОВ ФАЗА III ПРЕОБРАЗОВАНИЕ АКТИВНЫХ ПРОМЕЖУТОЧНЫХ ЭЛЕКТРОФИЛЬНЫХ МЕТАБОЛИТОВ В ВОДОРАСТВОРИМЫЕ НЕТОКСИЧНЫЕ КОМПОНЕНТЫ ВЫВЕДЕНИЕ ВОДОРАСТВОРИМЫХ НЕТОКСИЧНЫХ КОМПОНЕНТОВ ИЗ ОРГАНИЗМА ОКСИДАТИВНЫЙ СТРЕСС, ТОКСИЧНОСТЬ, МУТАЦИИ, РАК Совместное функционирование всех фаз детоксикации обеспечивает обезвреживание десятков тысяч ксенобиотиков всех химических классов и разных групп, включая канцерогены, мутагены, тератогены, пестициды, промышленные и сельскохозяйственные яды, пищевые добавки, красители и т. д.

Метаболизм ЛС Все ксенобиотики, в том числе и ЛС, имеют ограниченное число путей метаболизма Метаболизм ЛС Все ксенобиотики, в том числе и ЛС, имеют ограниченное число путей метаболизма n Всего около 100 ферментов, 30 генов имеют полиморфные аллели n Существуют «быстрые» , «нормальные» и «медленные» полиморфные варианты n

Субстратная специфичность цитохромов Р 450 n CYP 2 D 6 Амитриптилин, клозапин, кодеин, галоперидол, Субстратная специфичность цитохромов Р 450 n CYP 2 D 6 Амитриптилин, клозапин, кодеин, галоперидол, имипрамин, лидокаин, лоратодин, метопролол, пропафенон, пропранолол и др. n СYP 1 A 2 Ацетаминофен, кофеин, тамоксифен, эстрадиол, теофиллин, фенацетин и др. n CYP 2 C 9 Диклофенак, напроксен, фенитоин, пироксикам, тамоксифен и др. n CYP 2 C 19 Амитриптилин, диазепам, имипрамин, индометацин, омепразол, папаверин, пропранол, триметадон и др.

ПРИМЕР ГИБРИДИЗАЦИИ НА “ФАРМАГЕН - БИОЧИПЕ” 1 3 2 4 Генотип: CYP 1 A ПРИМЕР ГИБРИДИЗАЦИИ НА “ФАРМАГЕН - БИОЧИПЕ” 1 3 2 4 Генотип: CYP 1 A 1 (*2 B/*1), CYP 2 D 6 (*4/*4), GSTT 1 (+/+), GSTM 1 (+/+), NAT 2 (S 2/N), MTHFR (C/C), CYP 2 C 9 (*1/*1), CYP 2 C 19 (*2/*1) Стрелками указаны обнаруженные “мутантные” варианты

АНАЛИЗ ГИБРИДИЗАЦИИ НА БИОЧИПЕ С ПОМОЩЬЮ ПРОГРАММЫ Image. Ware АНАЛИЗ ГИБРИДИЗАЦИИ НА БИОЧИПЕ С ПОМОЩЬЮ ПРОГРАММЫ Image. Ware

Полиморфизм гена CYP 2 C 9 и терапевтическая доза (мг/сутки). C. R. Lee et Полиморфизм гена CYP 2 C 9 и терапевтическая доза (мг/сутки). C. R. Lee et all. 2002. Pharmacogenetics. Генотип Выборка 794 *1*1 *1*2 *1*3 *2*2 *2*3 *3*3 5. 28 3. 52 0, 5 4, 59 3, 78 3. 04

ТРМТ - БИОЧИП Фармакогенетика лейкозов Ген Thiopurine S-methyltransferase (TPMT) локализован на хромосоме 6 p ТРМТ - БИОЧИП Фармакогенетика лейкозов Ген Thiopurine S-methyltransferase (TPMT) локализован на хромосоме 6 p 22. 3 и состоит из 9 интронов и 10 экзонов. Белковый TPMT инактивирует: 6 меркаптопурин, азатиоприн, 6 - тиогуанин ( острые лейкозы, саркомы лимфолейкозы, хрон. миелолейкозы, ИНДИВИДУАЛЬНАЯ ДОЗИРОВКА ! - 1 из 300 европейцев - гомозигота по аллелю с очень низкой ферментной активностью по данному локусу. ~ 10 % индивидов - гетерозиготы по аллелю со средней активностью. ~ 89% людей - гомозиготы по аллелю с высокой активностью.

TPMT-БИОЧИП Схема TPMT-биочипа Генотип *1/*1 (дикий тип) G 238 Гомозигота *2/*2 G 238 C TPMT-БИОЧИП Схема TPMT-биочипа Генотип *1/*1 (дикий тип) G 238 Гомозигота *2/*2 G 238 C G 644 T 681 A 719 G 292 G 460 G 644 T 681 A 719 С 238 T 292 A 460 A 644 G 681 G 719 С 238 мутации G 460 G 238 Дикий тип G 292 T 292 A 460 A 644 G 681 G 719 Гетерозигота *1/*3 A *2/*3 A G 460 A A 719 G G 238 C G 460 A A 719 G Гетерозигота *1/*8 G 644 A

ДИАПАЗОН ДОЗИРОВКИ 6 МП Для гетерозигот 264 до 312 мг/м 2/неделя) wt/wt wt/mut ДИАПАЗОН ДОЗИРОВКИ 6 МП Для гетерозигот 264 до 312 мг/м 2/неделя) wt/wt wt/mut

СУДЕБНОМЕДИЦИНСКАЯ ЭКСПЕРТИЗА n Идентификация личности n Установление кровного родства СУДЕБНОМЕДИЦИНСКАЯ ЭКСПЕРТИЗА n Идентификация личности n Установление кровного родства

Метод ДНК-фингерпринт ДНК-дактилоскопия, метод «отпечатков пальцев ДНК» Предложен в 1987 году Недостатки - Трудоемкий Метод ДНК-фингерпринт ДНК-дактилоскопия, метод «отпечатков пальцев ДНК» Предложен в 1987 году Недостатки - Трудоемкий и капризный - Требуется большое количество ДНК - Сложная система контроля

Принцип идентификации личности: анализ локусов, содержащих STR (короткие тандемные повторы) Принцип идентификации личности: анализ локусов, содержащих STR (короткие тандемные повторы)

Количество локусов (STR), необходимое для идентификации личности Минимум – 4 -5 локусов n Стандарт Количество локусов (STR), необходимое для идентификации личности Минимум – 4 -5 локусов n Стандарт CODIS (США) – 7 локусов n Стандарт CODIS в случае особой важности – 14 локусов n Всего известно около 30 000 локусов, содержащих STR n

Два этапа ДНК-диагностики в судебномедицинской экспертизе n Выявление совпадений Если совпадения выявлены, то необходим: Два этапа ДНК-диагностики в судебномедицинской экспертизе n Выявление совпадений Если совпадения выявлены, то необходим: n Расчет вероятности того, что совпадение не случайно

Необходимый предварительный этап ПОПУЛЯЦИОННЫЙ АНАЛИЗ STRЛОКУСОВ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ДЛЯ ЭКСПЕРТИЗЫ ПОЗВОЛЯЕТ ОЦЕНИТЬ ЧАСТОТЫ АЛЛЕЛЕЙ, И, Необходимый предварительный этап ПОПУЛЯЦИОННЫЙ АНАЛИЗ STRЛОКУСОВ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ДЛЯ ЭКСПЕРТИЗЫ ПОЗВОЛЯЕТ ОЦЕНИТЬ ЧАСТОТЫ АЛЛЕЛЕЙ, И, СЛЕДОВАТЕЛЬНО, ГЕНОТИПОВ, В ПОПУЛЯЦИИ

Необходимая точность 99, 98%- точность идентификации 0, 02% или 1 из 5 000 – Необходимая точность 99, 98%- точность идентификации 0, 02% или 1 из 5 000 – вероятность случайного совпадения

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КРОВНОГО РОДСТВА n В 95% случаев – вопросы спорного отцовства ОПРЕДЕЛЕНИЕ КРОВНОГО РОДСТВА n В 95% случаев – вопросы спорного отцовства

Правила опровержения n Для опровержения отцовства в геноме ребенка и предполагаемого отца должно быть Правила опровержения n Для опровержения отцовства в геноме ребенка и предполагаемого отца должно быть выявлено несовпадение по крайней мере по двум локусам

Необходимая точность 99, 75% - «отцовство практически доказано» Необходимая точность 99, 75% - «отцовство практически доказано»

ГЕНОМНАЯ ДАКТИЛОСКОПИЯ НА БИОЧИПАХ A). Субъект 1. генотип HLA- DQA 1*102/ 501, AMEL XY ГЕНОМНАЯ ДАКТИЛОСКОПИЯ НА БИОЧИПАХ A). Субъект 1. генотип HLA- DQA 1*102/ 501, AMEL XY B). Субъект 2. генотип HLA- DQA 1*501/ 501, AMEL XY C). Кровь с поверхности ножа генотип HLA- DQA 1*501/ 501, AMEL XY принадлежит субъекту 2

Генетика и фенотип Генетика обуславливает многие количественные и качественные признаки человека Наследуемость признаков составляет: Генетика и фенотип Генетика обуславливает многие количественные и качественные признаки человека Наследуемость признаков составляет: Рост – 80 -85% Артериальное давление – 40 -45% Масса тела – 70 -80% Уровень липидов – 60 -80% Цвет глаз, кожи, волос – 95 -99% Выносливость – 65% Форма ушей – 98% Быстрота – 80% Сахарный диабет – 60% Интеллект – 70%

Генетические маркеры цвета глаз Ученые из медицинского центра Роттердамского университета ( Erasmus University Medical Генетические маркеры цвета глаз Ученые из медицинского центра Роттердамского университета ( Erasmus University Medical Center Rotterdam) проанализировали 37 SNP из 8 генов у 6000 коренных жителей Роттердама (Liu et al. , 2009). 67. 6% из них имели голубые глаза, 22. 8% - карие, 9. 6% - промежуточный цвет глаз. В итоге были отобраны лишь 6 наиболее значимых замен в 6 генах. Все эти гены кодируют белки, отвечающие за производство составляющих радужной оболочки глаза, кожи и пигментов волос (эумеланин и феомеланин). Ген HERC 2 OCA 2 SLC 24 A 4 SNP rs 12913832 rs 1800407 rs 12896399 SLC 45 A 2 rs 16891982 TYR rs 1393350 IRF 4 rs 12203592 Тестирование этих генов позволяет предсказать карий цвет глаз с вероятностью 93%, голубой — 91%, промежуточный цвет - 73%.

Генетические маркеры веса человека Вес (масса) тела - один из важнейших показателей физического состояния Генетические маркеры веса человека Вес (масса) тела - один из важнейших показателей физического состояния человека. Полногеномные исследования позволили выявить целый ряд локусов на различных хромосомах ответственных за ожирение. Например: Ген Функция продукта гена SNP MGAT 1 Участвует в метаболизме углеводов, необходим для преобразования маннозы. rs 12517906 FTO Участвует в регуляции глобального обмена веществ, расхода энергии и энергии гомеостаза. Также участвует в регуляции размеров тела и накопления жировых отложений. rs 8050136 TMEM 18 Участвует в клеточной миграции, усиливает миграционную способность нервных стволовых клеток и нейронных клеток-предшественников. rs 7561317 MC 4 R Вовлечен в спектр физиологических функций, в т. ч. энергетический гомеостаз, обмен веществ, пигментация, воспаление. rs 12970134 … (по Thorleifsson et al. , 2009) rs 6499640

Способ прогнозирования роста человека на основании исследования ДНК в рамках русской популяции Yрост мужчины=176, Способ прогнозирования роста человека на основании исследования ДНК в рамках русской популяции Yрост мужчины=176, 17+3, 01*X 1 -1, 95*X 21, 73*X 3, где Х 1=0 (при генотипе 1 по гену 1), Х 2=0 (при генотипе 1 по гену 2), Х 3=0 (при генотипе 1 по гену 3). Т. е. Y=176, 17+3, 01*0 -1, 95*01, 73*0=176, 17. Прогнозный рост для индивида Х составляет 176, 17 см+ 4, 6 см. Параметр/ Характеристики Скорректированный Мужчины/рост стоя 0, 109 Женщины/рост сидя стоя сидя 0, 127 0, 013 0, 006 2, 9 4, 6 2, 8 коэффициент детерминации (adjusted R-squared) Средняя ошибка, см 4, 6

Гены энергетического обмена -регуляция углеводного обмена -регуляция липидного обмена -регуляция термогенеза Геныассоциированные с , Гены энергетического обмена -регуляция углеводного обмена -регуляция липидного обмена -регуляция термогенеза Геныассоциированные с , композитным составом мышечных волокон и силой сжатия кисти Гены метаболизма костной ткани Геныобуславливающие , антропометрические данные человека СПОРТИВНАЯ ГЕНЕТИКА Геныассоциированные , остротой зрения и заболеваниями органов зрения Гены метаболизма ксенобиотиков Гены сердечнососудистой системы - гены регуляции артериального давления - гены тромбофилии -гены «патологической гипертрофии» - гены регуляции роста сосудов Гены мотивации и стрессоустойчивости

Что важно для экстремального спорта: I. ЗДОРОВЬЕ II. ПРАВИЛЬНОЕ ЛЕЧЕНИЕ III. ИНДИВИДУАЛЬНАЯ МОТИВАЦИЯ IV. Что важно для экстремального спорта: I. ЗДОРОВЬЕ II. ПРАВИЛЬНОЕ ЛЕЧЕНИЕ III. ИНДИВИДУАЛЬНАЯ МОТИВАЦИЯ IV. РАЦИОНАЛЬНОЕ ПИТАНИЕ V. ОПТИМИЗАЦИЯ РЕЖИМА ТРЕНИРОВОК

Генетические маркеры кардиопатологий Гены, продукты которых отвечают за энергетический обмен: PPARA, PPARD, PRARG, UCP Генетические маркеры кардиопатологий Гены, продукты которых отвечают за энергетический обмен: PPARA, PPARD, PRARG, UCP 2, UCP 3, PPARGC 1 A (PGC-1α) Ген, ответственный за рост миокарда: PPP 3 R 1 (Cn. B) Гены, продукты которых отвечают за синтез и активность факторов свертывания крови и фибринолиза: F 5, F 7, F 1, F 2, рецепторы тромбоцитов (GP 3 a, GPIa), PLAT, PAI 1 и др. Гены, продукты которых отвечают за метаболизм липидов: APOA, APOCIII, APO(a), APOB, APOE, PON 1, r. LDL, LPL и др. Гены, продукты которых отвечают за сокращение сосудов и гены ренинангиотензиновой-системы: NOS 3, EDN 1, EDNRA, MTHFR, MTRR, ADRB 2, ADRB 1, REN, AGT, ACE, AGT 2 R 1, AGT 2 R 2, BKR 2.

Международные рекомендации генетического тестирования на наследственные формы тромбофилии Международные рекомендации генетического тестирования на наследственные формы тромбофилии

• Что даст экстремальным видам спорта генетическое тестирование? Медицинское обеспечение и тренировки + • Что даст экстремальным видам спорта генетическое тестирование? Медицинское обеспечение и тренировки + Генетика Медицинское обеспечение и тренировки Хронические болезни • • Отсутствие мотивации Некорректное спортивное питание Выбран не тот вид нагрузки Некорректные тренировки • • Исключены (более 99%) риски заболеваний несовместимых с занятием спортом Установлены наследственные риски наиболее частых видов спортивного травматизма Обоснован выбор вида спорта Индивидуальный подход к тренировкам Подбор питания согласно особенностям индивидуального метаболизма Обоснованная мотивация Высокие спортивные результаты

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПАСПОРТ Генетический паспорт - индивидуальная база ДНК-данных, отражающая уникальные генетические особенности каждого человека, ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПАСПОРТ Генетический паспорт - индивидуальная база ДНК-данных, отражающая уникальные генетические особенности каждого человека, его предрасположенность к тем или иным наследственным, мультифакториальным и другим заболеваниям (В. С. Баранов, 2000). Тестирование генов «предрасположенности» - путь к ранней профилактике частых заболеваний и коррекции образа жизни Паспортизация актуальна: супругам, беременным женщинам, спортсменам, людям экстремальных профессий ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПАСПОРТ СКОРО ПОНАДОБИТСЯ ВСЕМ !