Молекулярная биология ПЦР в диагностике заболеваний МОЛЕКУЛЯРНАЯ

Молекулярная биология, ПЦР в диагностике заболеваний

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА • Фундаментальные открытия второй половины • XX века в области изучения структуры, функций, свойств ДНК и белков привели к бурному развитию молекулярнобиологических методов исследования, к которым относятся методы молекулярной диагностики. Молекулярная диагностика за последние 1015 лет стала неотъемлемой частью медицинской науки и практики.

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА • Множество возбудителей инфекционных • • • болезней остаются малоизученными Кишечные инфекции продолжают оставаться одной из актуальных проблем здравоохранения России Остается актуальной проблема ВИЧинфекции Лидирующая роль в диагностике ИППП принадлежит молекулярным методам

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА • Решаются вопросы репродуктивного здоровья • • • при инфекциях беременных и новорожденных Проводится молекулярная диагностика гриппа птиц и других респираторных инфекций Молекулярная диагностика особо-опасных инфекций Молекулярная диагностика инфекционных болезней животных

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА • Изучение диагностики туберкулеза, • • • типирование и обнаружение маркеров лекарственной устойчивости в геноме микобактерий Диагностика генетических заболеваний Диагностика онкологических заболеваний Диагностика генетически модифицированных источников пищи

ПЦР в диагностике заболеваний • Молекулярно-биологические методы находят широкое применение в клинической диагностике инфекционных заболеваний • ПЦР применяется в случае трудно культивируемых, медленно растущих и некультивируемых микроорганизмов

ПЦР в диагностике заболеваний ПЦР определяются 80 ДНК/РНК: • ВИЧ; • вирусного гепатита А, В, С, D; • Вируса гриппа птиц; • Респираторного синдрома SARS; • Дифтерии; • Туберкулеза; • Возбудителей особо-опасных инфекций; • ИППП; • Возбудителей ОКИ

ПЦР в диагностике заболеваний • • • Что такое ПЦР История Принцип метода Области применения Тенденции развития

Что такое ПЦР • Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – молекулярно-биологическая реакция, позволяющая быстро получить большое количество копий конкретного фрагмента ДНК • Искомый фрагмент может быть частью очень сложной смеси нуклеиновых кислот • Исходным материалом для ПЦР может быть даже единственная молекула ДНК • ПЦР позволяет быстро получить детектируемое количество ДНК

Особенности метода • Прямой метод • Высокая чувствительность • Специфичность • Универсальность • Воспроизводимость • Скорость • Технологичность • Низкая стоимость

Изобретение • • 1955 г. - открытие ДНК-полимеразы Принцип ПЦР сформулировал Гобинд Корана в 1971 1975 г. - открытие Thermus aquaticus В 1983 Кэри Мюллису удалось провести ПЦР • 1985 г. - амплификация бета • глобина В 1993 за изобретение ПЦР Кэри Мюллису вручена Нобелевская премия по химии

Механизм ПЦР Основные компоненты: • Праймеры • Tag - полимераза • Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов • Буфер • Анализируемый образец Дополнительные компоненты: • Внутренние контроли • ДНК - зонды

Стадии постановки ПЦР • Подготовка пробы биологического материала • Амплификация • Детекция в агарозном геле

Пробоподготовка (подготовка пробы биологического материала) • Упрощенные методики (кипячение, протеолиз) • Классическая методика (получение чистого препарата ДНК/РНК) • Сорбция ДНК (GSCN + сорбция ДНК на носителе) • Использование ионообменников (Chilex)

На чем основана амплификация • Использование термостабильной полимеразы (Taq-полимераза) • Полимераза достраивает специфические затравки (праймеры) • Процесс состоит из повторяющихся температурных циклов

Механизм ПЦР Температурный цикл амплификации состоит из трех этапов: • Денатурация • Отжиг • Элонгация (синтез)

Детекция • Использование интеркаляторов - Электрофорез - Real-time машины • Использование праймеров и ДНК-зондов, меченных флуоресцентными метками - гибридизация после амплификации - гибридизация во время амплификации

Стадии постановки «классической» ПЦР

Как все происходит

Экспоненциальная амплификация

Проблема контаминации Контаминация Ложные результаты Высокие требования к организации ПЦР-лаборатории

Варианты контаминации продуктами амплификации 1. Контаминация специфическими продуктами амплификации Ложно-положительные результаты 2. Контаминация неспецифическими продуктами амплификации Дополнительные полосы Шмеры Димеры праймеров Ложно-положительные Ложно-отрицательные результаты

Изобретение флуоресцентной ПЦР • Метод «FLASH» (Fluorescent • Amplification-based Specific Hybridization) – специфическая гибридизация в процессе амплификации с ДНК-зондами, меченными флуорофорами). Регистрация флуоресценции происходит с помощью специального прибора «Джин» » после окончания реакции

Основы «флуоресцентной» ПЦР • эффект переноса энергии (гашение флуоресценции) • 5’-экзонуклеазная aктивность Taq-полимеразы

Нанодиагностика (обнаружение ДНК)

Контроль за прохождением реакции

Качественный и количественный анализ • Качественный анализ: – – – любой материал для исследований ответ: ДА/НЕТ для скрининга и идентификации – – только «количественный» материал ответ: сколько инф. ед. на мл для уточнения диагноза и выбора терапии для контроля за ходом терапии и т. д. • Количественный анализ

Эпоха ПЦР изобретение «классической» ПЦР расцвет «классической» ПЦР, изобретение «флуоресцентной» ПЦР расцвет флуоресцентной» ПЦР 1983 1993 2004

Особенности «классической» ПЦР • Высокая чувствительность • Высокая специфичность • Универсальность НО • Проблема контаминации • Отсутствие количественного анализа

Особенности «флуоресцентной» ПЦР • Высокая чувствительность • Высокая специфичность • Универсальность + • Решение проблемы контаминации • Возможность количественного анализа • Технологичность

Применение ПЦР • Медицина – диагностика инфекций, наследственных заболеваний, иммунных патологий, онкологических заболеваний – HLA генотипирование при трансплантациях • Ветеринария и растениеводство - Инфекционные заболевания - Определение видовой принадлежности • Наука – генная инженерия, микробиология, генетика и др.

Применение ПЦР • Промышленность • • - определение биологического загрязнения (санитарный контроль) Санитарно-эпидемиологический контроль – Вирусология – Микробиология – Определение ГМИ пищевых продуктов Судебная медицина - Идентификация личности

Медицина • Гемотрансфузионные инфекции (качественное и количественное определение) • Оппортунистические инфекции • ИППП • Заболевания дыхательной системы (туберкулез и др. ) • • Эпидемические инфекции HLA-типирование Исследование биоценозов И др…

Гемотрансфузионные инфекции качественное определение • ПЦР покажет присутствие вирусов в период «серологического окна» ВИЧ и гепатитов • С 1999 года в странах ЕС генотестирование стало обязательным для всей донорской крови и плазмы

ПЦР в диагностике ВИЧ Методом ПЦР определяют непосредственно гены ВИЧ, он незаменим при диагностике ВИЧ-инфекции: в серонегативный период; исследовании банков крови и препаратов из крови; при неопределенных результатах ИФА; у детей, рожденных ВИЧ-инфицированными матерями (персистенция материнских антител у ребенка может достигать 15 мес. ); при одновременной диагностике множественных инфекций, встречающихся при СПИДе; при дифференциальной диагностике между ВИЧ-1, ВИЧ-2 и другими вирусными заболеваниями, определении соотношения между клеточным и внеклеточным вирусом, при испытаниях на животных химиопрепаратов и вакцин против СПИДа.

Гемотрансфузионные инфекции количественное определение • Количественное определение (вирусная нагрузка) используется для мониторинга эффективности противовирусной терапии (ВИЧ, гепатиты В и С) • Генотипирование вируса гепатита С позволяет прогнозировать эффективность лечения

Оппортунистические инфекции • Протозойные инфекции – пневмоцистная пневмония • Грибковые инфекции – генерализованный кандидоз • Вирусные заболевания - генерализованные инфекции, вызванные вирусом простого герпеса, CMV, EBV, паповавирусом, распространенный опоясывающий лишай. • Бактериальные инфекции - могут протекать нетипично

ИППП хламидиоз, микоплазмоз, трихомониоз, уреаплазмоз, гонорея и др. • Часто протекают бессимптомно • Часто встречаются атипичные формы, трудно • • диагностируемые обычными методами (микроскопия мазка) Микст-инфицирование Крайне неприятные последствия

ПЦР в диагностике ИППП Можно определить следующие показания к выявлению T. urogenitalis, N. gonorrhoeae, M. genitalium, C. trachomatis и др. методом ПЦР: - латентное, бессимптомное течение заболевания - Выявление возбудителя на фоне микст-инфекции - Контроль эффективности лечения - Контроль объективности микроскопического исследования - Проведение скрининговых исследований

Заболевания дыхательной системы туберкулез • Туберкулез – социально-значимое • • • заболевание Традиционные методы требуют либо большого кол-ва бактерий (105 в мл) либо длительного срока ожидания результата (до 2 -х месяцев) Трудности диагностики внелегочных форм туберкулеза традиционными методами Возможно определение чувствительности МБТ к ряду химиотерапевтических препаратов за 1 день вместо 3 недель

Диагностика наследственных заболеваний • ПЦР позволяет проводить пренатальную диагностику наследственных заболеваний, таких как: – – – – Фенилкетонурия Муковисцидоз Миодистрофия Дюшенна/Беккера Хорея Гентингтона Гемофилия А, В Болезнь Вильсона-Коновалова и др. …

Онкология Основные направления использования ПЦР в онкологической патологии включают: – – – – ДНК-диагностику наследственных форм рака. ДНК-диагностику спорадических форм рака. Определение микрометастазов. ДНК-диагностику биологических канцерогенов (HPV 16 и 18 типов, ВЭБ-инфекции, HBV и HCV, ретровирусы и т. п. ). Доклиническую диагностику опухолей (определения протоонкогенов). Прогноз заболевания и успешности назначаемой терапии, а также эффективность проведенного лечения на основе диагностики функциональной активности онкогенов. Исследование «архивных» биоптатов с установленным клинико-гистологическим диагнозом. Это важно в оценке диагностической значимости предполагаемого маркера и правильности терапии.

Иммунология • Оценка уровня экспрессии генов, кодирующих белки иммунного ответа в клетках, тканях, тканевых жидкостях • Определение цитокинового профиля: – диагностика заболеваний – патогенетические особенности – эффективность терапии

Эпидемические инфекции • Созданы и внедрены в практику по федеральному уровню тест-системы для выявления методом ПЦР возбудителей чумы, сибирской язвы, бруцеллеза и холеры • Разработаны ПЦР-тест-системы для индикации вирусов Западного Нила, Крым-Конго геморрагической лихорадки и идентификации вирусов ГЛПС • Доказана возможность использования ПЦР для детекции наличия ВГА в окружающей среде

HLA-типирование • Подбор доноров для трансплантации органов • Исследования привычном невынашивании беременности у супружеских пар • Дифференциальная диагностика и прогноз аутоиммунной патологии

Ветеринария Существуют тест-системы для выявления ряда заболеваний животных: - Сибирской язвы, бруцеллеза Туберкулеза Лептоспироза Вируса классической чумы свиней Вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней и вируса респираторного коронавируса свиней Вируса чумы плотоядных животных

ПЦР в ветеринарии • Этот метод позволяет быстро, в течение суток (что важно при завозе племенного материала извне), с высокой специфичностью выявлять заболевания крупного рогатого скота: ринотрахеит, хламидиоз, лептоспироз, лейкоз и другие. Для выявления вирусов, бактерий или простейших, вызывающих заболевание, достаточно нескольких капель крови, спермы, молока, мочи или кусочек ткани животного. Метод является очень чувствительным и позволяет выявить 2 -5 патогенов в образце. Преимуществом этого метода является также возможность диагностики заболевания на ранних стадиях развития, в инкубационном периоде и при течении в скрытой, нетипичной форме.

ГМО - генетически модифицированные организмы ПЦР позволяет осуществлять: • контроль за использованием ГМ организмов (ГМО) • контроль за наличием и процентным содержанием ГМ ингредиентов (ГМИ) в пище

Организация контроля за ГМИ Производитель ГМИ Научная экспертиза (Монсанто) (Научно-исследовательский институт) Заключение о безопасности, (Минздрав) разрешение к использованию Пострегистрационный мониторинг (Службы контроля)

Пострегистрационный мониторинг МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ ЗА ГМИ ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА ИММУНОФЕРМЕНТНЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВОГО СОСТАВА ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ (ПЦР) ДЕТЕКЦИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНК

Современные тенденции развития ПЦР • Упрощение и ускорение проведения рутинных качественных и количественных анализов • Использование для оценки экспрессии генов • Разработка «real-time» методов детекции однонуклеотидных замен

Количественный анализ: ДТ-322 • Предназначен для • • проведения количественной ПЦР Одновременная постановка 32 пробирок Удобное программное обеспечение на русском языке

Принципы количественного анализа в real-time ПЦР