Молекулярная биология Мерцалов Григорий Истра 2013 Что

Молекулярная биология Мерцалов Григорий Истра 2013

Что нас ждет • • • Организация ДНК в ядре Репликация +р ег Транскрипция ул яц ия Трансляция Репарация ДНК

Два уровня организации генома Прокариоты • Как правило, одна кольцевая молекула ДНК Эукариоты • Индивидуальный набор линейных молекул ДНК

Кольцевая молекула ДНК

ДНК меломана

Что делать? ? • ДНК-хеликаза – гексамер, расплетает двойную спираль (бежит впереди паровоза) • Топоизомеразы I – вносят одноцепочечные разрывы для релаксации молекулы. Остаток Tyr связывает фосфат на 5’-конце (IA) либо 3’конце (IB) • Топоизомеразы II (гиразы) – димеры, вносят двуцепочечные разрывы, создавая или расплетая узел. Важны для разделения катенанов. Остатки Tyr связывают 5’фосфаты.

,

Eukaryotic Nuclear Pore Complex

MARSAR - последовательности

Модификация гистонов (-> ДНК) Ацетилирование • Активация хроматина, экспрессия генов Метилирование • Инактиавция генов, образование гетерохроматина + фосфорилирование

Bednar, Jan et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14173 -14178 Copyright

Петли ДНК в ядрах клеток, экстрагированных 2 M раствором Na. Cl

Ядерный матрикс

Ядро Белковый матрикс

Оценка положения гена в петлях ДНК 50 -200 тыс п. н. на петлю

Хромосомные территории

Регулятлорные последовательности ДНК • Промоторы – инициируют транскрипцию гена, регулируются операторами • Энхансеры – усиливают экспрессию генов на расстоянии • Инсуляторы – блокируют распространение сигналов через себя, в т. ч. останавливают распространение гетерохроматина (MAR? SAR? ) • ИТД…

Инсуляторы - функциональные элементы генома, способные разделять домены Инсуляторы предотвращают действие энхансера на промотор, расположенный за инсулятором, не подавляя активности энхансера и не препятствуя его действию в другом направлении ген В ген А энхансер инсулятор

Инсуляторы - функциональные элементы генома, способные разделять домены Инсуляторы ограничивают распространение на окруженный инсуляторами трансген негативных сигналов из хроматина хозяйской клетки трансген Гетерохроматин хозяйской клетки инсулятор Гетерохроматин хозяйской клетки

РЕДУПЛИКАЦИЯ ДНК

Репликация

Репликатор у прокариот. Cтруктура Оri • Origin (Ori. C) – от 258 п. н. • Dna. A-боксы (13) – связывают Dna. A • AT-богатый участок (ДНК-расплетающий элемент) • 9 -14 GATC-сайтов (Dam-метилаза метилирует аденин – исключение повторной инициации)

Прокариоты (E. coli) Эукариоты (человек) Функция Dna. B Хеликаза Раскручивание спирали ДНК, АТФаза SSB RPA Стабилизация оц. ДНК γ-комплекс RFC Стимулирует clamp-loader, АТФаза (узнает праймер) τ-субъединица Pol III Координация синтеза на двух цепях, образование инициаторного комплекса Β 2 -clamp PCNA Фактор процессивности Pol III (αθε) Pol δ Основная ДНК-полимераза Dna. G Pol α (праймаза) Синтез РНК-праймеров Лигаза I Лигирование фрагментов ДНК Pol I FEN-1 (flap-endonuclease) Экзонуклеаза, удаление РНК -затравок РНКаза Н 1 Удаление РНК-затравок Pol γ Митохондрильная

Этапы инициации репликации • Ori. C + Dna. A-ATP → исходный комплекс • Высокая концентрация АТР →открытый комплекс (расплетание в АТ-богатой области) • + (Dna. B-Dna. C-ATP)*6 → Препраймирующий комплекс I • - 6 Dna. C - 6(ADP+P) → Препраймирующий комплекс II • + Dna. G → праймирующий комплекс • + гираза + Pol III → реплисома

Репликация линейных хромосом • Множество ARS (Autonomously Replicating sequences) • Узнаются ORC (Origin Recognition Complex) • Репликоны увеличиваются в ходе эмбриогенеза (замедляется скорость делений) • Содержат участки MARSAR прикрепления к ядерному белковому матриксу • Проблема недореплицированных концов теломер

Работа Лигазы

Транскрипция

РНК-полимераза прокариот Субъединица Мол. масса, к. Да Функции β’ 165 Несет шип (разделение цепей ДНК) и участвует в связывании ДНК β 155 Несет F-петлю (продвижение по ДНК), образует каталитический центр 2*α по 35 Структурная (правильная связь с промотором) ω ≈40 Структурная и стабилизирующая σ обычно 70 Специфичность взаимодействия РНКполимеразы с промотором (σ54 – для промоторов белков теплового шока)

Эукариотические РНК-полимеразы • I – транскрипция р. РНК • II – транскрипция м. РНК • III – транскрипция малых РНК (нк. РНК)

Промоторы и энхансеры • Состоят из определенных функционально значимых коротких консервативных послеовательностей • Некоторые последовательности встречаются в обоих типах • Эти фрагменты могут связывать одни и те же белки, выпетливая ДНК между П и Э и сближая их. • Энхансеры более плотно организованы и более кооперативно связывают факторы в энхансеросому

Инициация транскрипции • С промоторами связываются транскрипционные факторы и привлекают РНК-полимеразы • TBP- фактор, необходимый всем трем полимеразам • Основной комплекс факторов – TFII • TATA-бокс вблизи старта (-30)(связывается ТВР) • Участки -35 и -10 – связываются σ-фактором • Ср. G-динуклеотиды – окружают промоторы, должны быть неметилированы

Транскрипционные факторы • Основные факторы – белки, взаимодействующие с РНК-полимеразой в области стартовой точки • Активаторы – белки, взаимодействующие с промоторами и энхансерами и привлекающие прочих участников инициации транскрипции • Коактиваторы – вспомогательные белки

Домены транскрипционных факторов • Цинковые пальцы – содержат атом цинка, связанный цистеинами белка. • Домены «спираль-поворот-спираль» , • «Лейциновые молнии» - факторы димеризации

Регуляция экспрессии генов: MAPкиназы • Митогены – факторы, стимулирующие клетку к выходу из G 0 периода клеточного цикла • MAPKKK, MAPKK и MAPK – каскад белков, которые в ответ на эти факторы либо стрессовые факторы изменяют активность экспрессии определенных генов

Работа МАРК • Проникают в ядро и фосфорилируют транскрипционные факторы • Фосфорилируют ТФ в цитоплазме, позволяя им проникнуть в ядро • Фосфорилируют ингибитор ТФ, что приводит к его инактивации и высвобождению ТФ

Терминаторы транскрипции • У прокариот: • GC-reach + oligo-A • ρ-фактор-зависимые терминаторы (ρ-фактор – белок 46 к. Да с РНК-ДНКхеликазной активностью) • Аттенюаторы (триптофановый оперон) • У эукариот: • Факторы для каждой РНК-полимеразы

Уридиловое редактирвоание С помощью гидовой РНК в первичный транскрипт добавляются (либо удаляются) блоки уридиловых нуклеотидов AGUUCCAUUG-----CCUAGAUUCA пре-м. РНК UCAAGGUAACUUUUUGGAUCU--GU г. РНК

Митохондриальный криптоген G 5 трипаносоматид

Вобл-гипотеза Ф. Крика (1966) • Wobbling – качание

Аминоацил-т. РНК-синтетазы (АРСазы) • Активация аминокислоты в активном центре: • АК+АТФ → Ак-АМФ + пирофосфат • Аминоацилирование: • АРСаза-Ак-АМФ + 3’-ACC-т. РНК → АРСаза + АМФ + Ак-3’/2’-АСС-т. РНК

2 класса АРСаз • Содержат взаимоисключающие мотивы • 1 – мономеры. – Присоединяют к 2’-концу т. РНК – Активный центр – неглубокая выемка на поверхности белка. – Субстраты – аминокислоты с крупными радикалами • 2 – Олигомеры – Присоединяют к 3’-концу т. РНК (кроме Phe) – Активный центр – глубокий карман, удобный для селекции мелких радикалов аминокислот

ДВА КЛАССА АМИНОАЦИЛ-т. РНК-СИНТЕТАЗ Класс II Leu, Ile, Val, Cys, Met, Glu, Gln, Arg, Tyr, Trp His, Pro, Ser, Thr, Asp, Asn, Lys, Gly, Ala, Phe

АRS - t. RNA COMPLEX D-loop side contact TΨ-loop side contact

РИБОСОМЫ НА УЛЬТРАТОНКИХ СРЕЗАХ БАКТЕРИЙ Vibrio alginolyticus

РИБОСОМЫ НА УЛЬТРАТОНКОМ СРЕЗЕ КЛЕТКИ ГИПОФИЗА КРЫСЫ

70 S РИБОСОМА

Сравнение размеров и формы рибосомных субъединиц и их изолированных РНК в компактной конформации 50 S 30 S 23 S РНК 16 S РНК

ДОМЕННАЯ CТРУКТУРА 16 S РНК

ТРЕТИЧНАЯ СТРУКТУРА 16 S РИБОСОМНОЙ РНК

СОПРЯЖЕННАЯ ТРАНСКРИПЦИЯ-ТРАНСЛЯЦИЯ ПРОКАРИОТ

РАБОЧИЙ ЦИКЛ ТРАНСЛИРУЮЩЕЙ РИБОСОМЫ (ЭЛОНГАЦИОННЫЙ ЦИКЛ) Связывание

EF-Tu (EF 1 A) GDP Form GTP Form

AMINOACYL -t. RNA • EF-Tu (EF 1 A) • GTP COMPLEX t. RNA 3 2 EF 1 A 1

ТРАНСПЕПТИДАЦИЯ

EF-G

МОЛЕКУЛЯРНАЯ МИМИКРИЯ: Aa-t. RNA: EF 1: GTP versus EF 2 (EF-G)

LOCKING-UNLOCKING HYPOTHESIS Unlocked state – for accepting and moving t. RNAs Translocation Binding of aminoacyl-t. RNA Locked state – for closing substrates and promoting chemical attack Transpeptidation

Инициация трансляции: поиск старта

НЕРАВНОМЕРНОСТЬ ЭЛОНГАЦИИ – ТРАНСЛЯЦИОННЫЕ ПАУЗЫ (1) Модулирующие кодоны: кодоны редких синонимных т. РНК, особенно их тандемы. (2) Структурные барьеры на м. РНК (стабильные шпильки, псевдоузлы, третичная структура). (3) Ингибиторные аминокислотные последовательности растущих пептидов.

ТРИ ПУТИ РАСТУЩЕГО ПОЛИПЕПТИДА: (1) Ко-трансляционное сворачивание в компактную глобулу. (2) Взаимодействие недосвернутого или неправильно свернутого полипептида с шаперонами. (3) Ко-трансляционная трансмембранная транслокация.

МАСКИРОВАНИЕ м. РНК

Методы в молекулярной биологии

Клонирование ДНК – выделение гена Клонирование ДНК Клон – бактерия, несущая данный ген Клон Что нужно для выделения гена? • ДНК - источник гена • вектор и подходящий хозяин • средства расщепления ДНК – рестриктазы • инструмент для объединения фрагментов – ДНК-лигаза • способ введения векторной ДНК в хозяина • способ идентификации клонов E. coli

Рестриктазы – специфические эндонуклеазы Рестриктазы (более 900 ферментов изолировано из 230 штаммов бактерий) Сайты расщепления двуспиральной ДНК тремя разными рестриктазами: «липкие» концы, 5’-overhang (5’-конец длиннее) «липкие» концы, 3’-overhang (3’-конец длиннее) «тупые» концы

Лигирование ДНК – образование эфирной связи Лигирование между конечными нуклеотидами исходная кольцевая плазмида обработка двумя рестриктазами линейная ДНК с сайтами рестрикции на концах + «вставка» , содержащая ген + лигаза векторная ДНК, содержащая ген

Векторная ДНК: • автономная репликация в бактериях или дрожжах • устойчивость к антибиотику • удобные сайты рестрикции (MCS) Размер вставки, которую могут нести: - плазмиды - до 10 тыс. пар оснований (п. о. ) - вирусы (фаги) - до 25 тыс. п. о. - космиды - до 45 тыс. п. о. - бактериальные искусственные хромосомы – до 300 тыс. п. о. - дрожжевые искусственные хромосомы - до 1 млн. п. о.

Электрофорез ДНК: разделение молекул по размеру Электрофорез ДНК подвижность молекул ДНК зависит от плотности агарозного геля концентрация агарозы в геле присутствует бромистый этидий, который при 590 нм начинает флюоресцировать, связавшись с ДНК

Northern гибридизация РНК/ДНК: идентификация Northern транскрипта и оценка уровня экспрессии гена молекулы м. РНК разделяются электрофорезом и переносятся на мембрану мембрана затем инкубируется с ДНК-пробой, меченной радиоактивным фосфором или флюорохромом

Southern гибридизация (гибридизация по Саузерну): Southern детекция специфической ДНК - в бактериальной колонии: мембрана - или в препарате ДНК: так же, как при Northern гибридизации реплика лизис бактерий, фиксирование и денатурация ДНК инкубация с меченой пробой проявление автографа

Реакция полимеризации ДНК C ДНК-полимераза 5’ C A T G 3’ G T A C G T двухцепочечная «затравка» A C G T A C 5’

От последовательности нуклеотидов – к предполагаемой последовательности аминокислот Поиск открытой рамки считывания (ORF): ORF) 5‘-atgcccaagctgaatagcgtagaggggttttcatcatttgaggacgatgtataa-3' 1 atg ccc aag ctg aat agc gta gag ggg ttt tca ttt gag gac gat gta taa M P K L N S V E G F S S F E D D V * 2 tgc cca agc tga ata gcg tag agg ggt ttt cat ttg agg acg atg tat C P S * I A * R G F H H L R T M Y 3 gcc caa gct gaa tag cgt aga ggg gtt ttc att tga gga cga tgt ata A Q A E * R R G V F I I * G R C I В неправильных рамках часто встречаются стоп-кодоны (отмечены красной звездочкой)

Отто Леви

А. Ф. Самойлов: измерение температурной зависимости задержки в передаче возбуждения с нерва на мышцу (1922 -26 гг. )