Молекулярная биология Лекция 12. Регуляция. Скоблов Михаил Юрьевич
Парадокс количества и сложности: “Эволюционное качество” достигается не количеством генов, а их регуляцией.
Часть 1. Регуляция активности генов у прокариот
Типы регуляции активности генов у прокариотов Репрессия и индукция синтеза белков у прокариотов реализуют принципы адаптации к меняющимся условиям существования и клеточной экономии: ферменты появляются в клетках, когда в них существует потребность, и перестают вырабатываться, если потребность исчезает. Экспрессируемые гены можно поделить на следующие категории: • конститутивные, присутствующие в клетках в постоянных количествах независимо от метаболического состояния организма • индуцируемые, их концентрация в обычных условиях мала, но может возрастать в 100 раз и более, если, например, в среду культивирования клеток добавить субстрат такого фермента; • репрессируемые, т. е. ферменты метаболических путей, синтез которых прекращается при добавлении в среду выращивания конечного продукта этих путей.
Регуляция транскрипции у прокариот • Оперон — функциональная единица генома у прокариот, в состав которой входят цистроны (гены, единицы транскрипции), кодирующие совместно или последовательно работающие белки и объединенные под одним (или несколькими) промоторами. • Опероны по количеству цистронов делят на моно-, олиго- и полицистронные, содержащие, соответственно, только один, несколько или много цистронов (генов). • Концепцию оперона для прокариот предложили в 1961 году французские ученые Жакоб и Моно, за что получили Нобелевскую премию в 1965 году. Структура лактозного оперона Франсуа Жакоб Жак Люсьен Моно
Механизм работы лактозного оперона • Клетки Е. coli обычно растут на среде, используя в качестве источника углерода глюкозу. • Если в среде культивирования глюкозу заменить на дисахарид лактозу, то клетки адаптируются к изменившимся условиям, начав синтез трёх белков, обеспечивающих утилизацию лактозы. • Один из этих белков - фермент β-галактозидаза, катализирующий гидролитическое расщепление лактозы до глюкозы и галактозы
Механизм работы лактозного оперона a) В отсутствие индуктора (лактозы) белок-репрессор связан с оператором. РНКполимераза не может присоединиться к промотору, транскрипция структурных генов оперона не идёт b) В присутствии лактозы белок-репрессор присоединяет её, изменяет свою конформацию и теряет сродство к оператору. РНК-полимераза связывается с промотором и транскрибирует структурные гены.
Репрессия синтеза белков. Триптофановый оперон.
Репрессия синтеза белков. Триптофановый оперон.
Репрессия синтеза белков. Триптофановый оперон. • Выше описана система регуляции триптофанового оперона по принципу вкл/выкл. • Эта система реагирует на различные концентрации триптофана, изменяя скорость синтеза ферментов биосинтеза в 700 -кратном диапазоне • Как только репрессия ослабляется и начинается транскрипция, скорость транскрипции регулируется вторым более тонким регуляторным процессом называемым транскрипционная аттенюация (transcription attenuation - транскрипционное ослабление). • Транскрипционная аттенюация описана как процесс, в котором транскрипция инициируется как обычно, но резко останавливается перед транскрибирующимся опероном генов. • Частота, с которой транскрипция «ослабляется» зависит от имеющейся концентрации триптофана. • Основой данного механизма, разработанной Чарльзом Янофски, является очень сильная связь между транскрипции и трансляции у бактерий.
Терминация транскрипции у прокариот Терминация транскрипции может осуществляться по двум вариантам: Rho-зависимая терминация • контролируется Rho белком • фактор Rho связывается с растущей цепью РНК • в местах p-зависимой терминации транскрипции РНК- полимераза прекращает элонгацию • белок Rho дестабилизирует водородные связи между матрицей ДНК и м. РНК, высвобождая молекулу РНК Rho-независимая терминация • Контролируется последовательностью в ДНК-матрице • РНК-полимераза доходит до CGбогатого участка • Синтезированная молекула РНК формирует стебель-петлю, за которой расположено несколько урацилов, что приводит к отсоединению молекулы РНК от матрицы ДНК.
Репрессия синтеза белков. Триптофановый оперон. В лидерном пиптиде фенилаланино вого оперона среди 15 остатков 7 остатков фенилаланина, а в лидерном пиптиде гистидинового оперона — 7 подряд остатков гистидина.
Регуляция SOS-ответа • SOS-ответ представляет собой индуцируемую реакцию клеток на резкую остановку синтеза ДНК, вызванную повреждением ДНК, голоданием клетки или другими стрессовыми факторами. • Это реакция клетки на критическое состояние, приближающее ее к гибели. • Ключевыми регуляторными элементами являются • Репрессор Lex. A регулирующий транскрипцию всех SOS генов • Белок Rec. A способный связываться с одноцепочечной ДНК • Комплекс Rec. A-ss. DNA приводит к индукции SOS ответа, способствуя удалению Lex. A путём его авторасщеплению на два белковых фрагмента
Часть 2. Регуляция активности генов у эукариотов
Зачем нужна регуляция эукариотам? В организме человека имеется минимум 400 различных типов клеток, существенно различающихся по структуре и функциям
Зачем нужна регуляция эукариотам? Количество клеток в организме человека — около 100. 000 (100 триллионов , или 1014). • При рождении человека в мозгу насчитывается около 14 миллиардов клеток. • Это количество не увеличивается до самой смерти. • После того, как человеку исполняется 25 лет, ежедневно происходит сокращение количества клеток мозга на 100 тысяч.
Гены транскрибируются на разном уровне в разных тканях Если взять любую ткань, то мы увидим, что половина генов человека вообще в ней не экспрессируется, а другая половина имеет следующее распределение по уровням экспрессии
Разница между прокариотами и эукариот Прокариоты Эукариоты Структура генома Простая, в основном кольцевой геном Организован в хромосомы, нуклеосомная структура определяет доступность ДНК Размер генома Относительно небольшой Относительно большой Локализация транскрипции и трансляции Совмещённая Ядерная транскрипция и цитоплазматическая трансляция Организация генов Оперонная Оперонов в эукариотах не найдено. Каждый ген имеет собственный промотор и регулирующие элементы Статус транскрипции по умолчанию Вкл Выкл
Типы регуляции экспрессии генов эукариот
Транскрипционная регуляция экспрессии генов эукариот Транскрипционная регуляция определяет когда должна произойти транскрипция и как много РНК должно быть синтезировано. Транскрипционные факторы • Энхансеры • Сайленсеры • Инсуляторы Организация и статус хроматина • Модификации гистонов • ДНК-метилирование
Транскрипция у эукариот Транскрипционные факторы (ТФ) могут влиять на транскрипцию генов через несколько механизмов: • В литературе на сегодняшний день описано 1762 ТФ у человека. • В большинстве случаев изученных к настоящему времени ТФ стимулируют формирование комплекса преинициации на TATA- боксе за счет взаимодействия их транс- активирующих доменов с компонентами базального транскрипционного комплекса (либо непосредственно, либо через коактиваторы/ медиаторы ). • Некоторые ТФ вызывают изменения структуры хроматина , делая его более доступным для РНК-полимераз. • Другие ТФ являются вспомогательными, создавая оптимальную конформацию ДНК для действия других транскрипционных факторов. • Известны ТФ, которые подавляют транскрипцию за счет непосредственного действия своих ингибирующих доменов , либо нарушая совместное функционирование комплекса транскрипционных факторов внутри регуляторной области гена ( промотора, энхансера ).
Транскрипционная регуляция экспрессии генов эукариот Interactome maps of mouse gene regulatory domains reveal basic principles of transcriptional regulation. Kieffer-Kwon KR, Tang Z, Mathe E, Qian J, Sung MH, Li G, Resch W, Baek S, Pruett N, Grøntved L, Vian L, Nelson S, Zare H, Hakim O, Reyon D, Yamane A, Nakahashi H, Kovalchuk AL, Zou J, Joung JK, Sartorelli V, Wei CL, Ruan X, Hager GL, Ruan Y, Casellas R. Cell. 2013 Dec 19; 155(7): 1507 -20.
Транскрипционная регуляция экспрессии генов эукариот Для гена Mir 155 в B -клетках было найдено 83 взаимодействий промотора гена с различными энхансерами. Распределение выявленных взаимодействий «промотор-энхансер»
Транскрипционная регуляция экспрессии генов эукариот Interactome maps of mouse gene regulatory domains reveal basic principles of transcriptional regulation. Kieffer-Kwon KR, Tang Z, Mathe E, Qian J, Sung MH, Li G, Resch W, Baek S, Pruett N, Grøntved L, Vian L, Nelson S, Zare H, Hakim O, Reyon D, Yamane A, Nakahashi H, Kovalchuk AL, Zou J, Joung JK, Sartorelli V, Wei CL, Ruan X, Hager GL, Ruan Y, Casellas R. Cell. 2013 Dec 19; 155(7): 1507 -20.
Транскрипционная регуляция экспрессии генов эукариот Транскрипционная регуляция определяет когда должна произойти транскрипция и как много РНК должно быть синтезировано. Транскрипционные факторы • Энхансеры • Сайленсеры • Инсуляторы Организация и статус хроматина • Модификации гистонов • ДНК-метилирование
• Эпигенетика - область генетики, изучающая механизмы наследственности и изменчивости, в основе которых НЕ лежит изменение первичной последовательности ДНК и РНК. (С. Г. Инге. Вечтомов 2004 г. ) • Эпигенетическая регуляция – процесс, приводящий к изменению активности гена без изменений в его кодирующей последовательности, которое стабильно наследуется после исчезновения фактора, вызвавшего это изменение. • «Эпи» - в переводе с греческого «над» .
Эпигенетика • • Термин «эпигенетика» был введен в 40 -х годах XX столетия для описания изменений экспрессии генов в ходе развития. Английский исследователь Уоддингтон подвергал куколок дрозофил тепловому шоку и наблюдал изменение паттернов жилкования крыльев у взрослых мух. Измененные фенотипы воспроизводились в популяции на протяжении долгого времени после устранения индуцировавшего их стимула, что дало возможность предположить, что воздействие определенного средового фактора на протяжении критических периодов развития может продуцировать фенотипические изменения, которые сохраняются на протяжении всей жизни и даже могут переходить в последующие поколения. Уоддиктон назвал этот феномен «генетической ассимиляцией» . В современной литературе чаще используют термин «эпигенетика» .
Эпигенетика В 1957 году Конрад Халл Уоддингтон сформулировал концепцию «эпигенетического ландшафта» . • Процесс онтогенеза (индивидуальное развитие организма) - это пространство возможностей, "эпигенетический ландшафт", представляющий собой набор эпигенетических траекторий, ведущих от зиготы к взрослому состоянию организма. • Эпигенетические траектории в некоторой степени связаны между собой. • Под воздействием различных факторов (внутренних и внешних, генетических и негенетических) возможен переход с одной траектории на другую, в связи с чем, на основании одной и той же генетической программы возможно формирование множества траекторий онтогенеза (поливариантность онтогенеза). • Траектории, получающие преимущество, Уоддингтон называл креодами.
Эпигенетические модификации Модификации гистонов Модификации ДНК Модификации негистоновых белков хроматина Изменение статуса транскрипции
Метелирование ДНК
Метилирование ДНК – основной способ передачи эпигенетической информации у растений и млекопитающих • Не нарушает способность комплементарному взаимодействию , но стабилизирует двойную спираль ДНК и распознается многочисленными белками
Метилирование цитозина и аденина • Цитозин метилируется значительно чаще, чем аденин • Может происходить ферментов “спонтанно” без участия • Наиболее эффективно “спонтанно” метилируется цитозин в мотиве Cp. G
Распространенность метелирования у разных организмов Объект М. musculus H. sapiens Растения Насекомые (D. melanogaster) С. elegans S. cerevisiae N. crassa Наличие метилирования есть незначительно роль неизвестна нет есть
Частоты динуклеотидов у человека Frequencies of dinucleotides in human 10. 00 9. 00 8. 00 7. 00 6. 00 5. 00 4. 00 3. 00 2. 00 1. 00 0. 00 AA AT AG AC TA TT TG TC GA GT GG GC CA CT CG CC Part of human dinucleotides different from a chimpanzee 25. 00 20. 00 15. 00 10. 00 5. 00 0. 00 AA AT AG AC TA TT TG TC GA GT GG GC CA CT CG CC студентка третье курса ФМБФ МФТИ Светлана Овчинникова
Относительная распространенность Cp. G у разных организмов
Дезаминирование метилированого цитозина • В результате “спонтанного” дезаминирования метилированного цитозина возникает тимин, что приводит к мутации, закрепляемой при репликации ДНК • То же самое происходит в геномах in vivo, , результат – элиминация мотивов Cp. G (у растений – Cp. Np. G)
Cp. G островки Определения Cp. G островка: Frommer (1987) Any stretch of DNA greater than 200 bp with a GC content of greater than 50% and an observed to expected Cp. G ratio of greater than 0. 5 Takai (2002) Any stretch of DNA greater than 500 bp with a GC content of greater than 55% and an observed to expected Cp. G ratio of greater than 0. 6 • >200 пн, длина большинства островков - 0. 5 -3 т. п. н. • Относительно высокий GC-состав (>50, обычно>60%), плотное расположение мотива Cp. G (один на 10 пн, в 10 -20 раз выше, чем в среднем по геному) и его статистическая встречаемость • Как правило, содержат мотивы CCGCCC (сайты связывания транскрипционного фактора SP 1) • У человека - около 45000 островков. • 60% генов имеют с своём локусе Cp. G как минимум один остров. • Практически у всех генов “домашнего хозяйства”.
Свойства Cp. G островков • Cp. G островки располагаются с основном в промоторах и 5’ районах генов • Также часто распространнены и внутригенные, не захватывающие старт транскрипции • Существую и межгенные Cp. G островки
Свойства Cp. G островков • Cp. G-островки либо гипометилированы гиперметилированы, либо • Cp. G в промоторах обычно неметилированы, что необходимо для транскрипции соответствующего гена (метилирование, как правило, приводит к блоку транскрипции ) • Установленный статус метилирования, как правило, стабилен и в дальнейшем поддерживается.
Механизмы репрессии транскрипции, обусловленной метилированием. Прямой механизм 1. Метильные группы нарушают ДНК-белковые взаимодействия, выступая в большую бороздку ДНК и препятствуя связыванию специфических транскрипционных факторов. 2. Некоторые ТФ наоборот имеют повышенное сродство к метилированным сайтам. • Чувствительные к метилированию • AP-2, E 2 F, NFk. B, CREB, Myc/Myn • Нечувствительные к метилированию • SP-1, CTF Опосредованный механизм 3. Метилированные районы ДНК связывают MBD (methyl binding domain) – содержащие белки, привлекающие транскрипционные репрессоры или белки, модифицирующие гистоны. – Большинство MBD содержащих белков – репрессоры или корепрессоры транскрипции. – У Arabidopsis сущ. 12 MBD – содержащих белков. – МBD – содержащие белки могут формировать комплексы с деацетилазами гистонов (репрессорами).
В клетках млекопитающих действуют по крайней мере две системы метилирования, за которые отвечают разные метилазы Метилирование de novo вносит элементы изменчивости в профиль метилирования Поддерживающее метилирование обеспечивает поддержание уже сформированного профиля Поддерживающее метилирование активируется при каждом клеточном делении
Механизм наследования паттерна метилирования
Метилирование ДНК : основные функции • Поддержание структуры хроматина и стабильности хромосом • Сайленсинг повторенных и интегрированных чужеродных последовательностей • Механизм защиты против эффектов встраивания чужеродной ДНК высоко метилированы: • Сателлиты и другие повторяющиеся последовательности • Транспозоны, провирусные копии • Последовательности, характерные для гетерохроматина • Тканеспецифичное ненаследуемое долговременное подавление экспрессии генов на уровне транскрипции • Формирование профиля экспрессии, характерного для данного типа клеток высоко метилированы: • Транскрипционно неактивные гены (в гаметах – все, кроме • экспрессируемых гаметоспецифично) • Гены “опухолевой инвазии” и другие онкогены • Импринтированные гены гипометилированы: • транскрипционно активные гены непосредственное влияние метилирования на уровень экспрессии гена далеко не всегда понятно
Волны деметилирования в раннем эмбриогенезе • После оплодотворения отцовский геном активно деметилируется, в то время как материнский геном пассивно деметилируется. • На стадии имплантации эмбриона паттерны метилирования восстанавливаюся de novo для обоих родительских геномов. • После установления специфические паттерны метилирования поддерживаются в поколениях клеток, обеспечивая специфичность экспрессии генов • Таким образом, при смене поколений происходит последовательное цикличное метилирование/деметилирование по множеству позиций в геноме
Деметилирование ДНК глобальный характер млекопитающие – ранние этапы развития зародыша, старение cпецифический геномный импринтинг ДНК-деметилаза до сих пор не выявлена
Биологические функции метилированной ДНК • геномный импринтинг • инактивация Х-хромосомы • регуляция структуры хроматина • регуляция генной экспрессии • репликация ДНК • канцерогенез • клеточная дифференцировка • выключение трансгенов ( “silencing”)
Метилирование при раке Опухолевые процессы гиперметилирования характеризуются ключевых инактивацией генов-супрессоров и посредством гипометилирования активацией целого ряда онкогенов (raf, c-fos, c-myc, c-Haras, c-K-ras), факторов роста (IGF 2, TGF) и мобильных повторяющихся элементов, расположенных в районах гетерохроматина.
Часть 2. Ремоделинг хроматина
Эволюция нуклеосом
Структура коровых гистонов
Между ДНК и гистонами 14 различных взаимодействий
В геноме присутствуют Участки, свободные от нуклеосом Активные для транскрипции, сайты связывания транскрипционных факторов, регуляторных белков Участки, где положение нуклеосомы строго фиксировано +1 нуклеосома в генах (дрожжи – от +1 нуклеотида, позвоночные – от +60) Участки, в которых нуклеосомная укладка подвержена регуляции белками АТФ-зависимого ремоделинга хроматина
Пост-трансляционные модификации гистонов регуляторных N-концов
Пост-трансляционные модификации гистонов регуляторных N-концов • Ацетилирование лизин (K) • Метилирование лизин (K) аргинин(R) • Фосфорилирование серин(S) треонин(T) • Убиквитинилирование лизин (К) • ADP-рибозилирование • Сумоилирование
Роль пост-трансляционных модификаций гистонов Изменение электростатического взаимодействия между гистонами и ДНК: • Поли. АДФрибозилирование приводит к тому, что гистоны или негистоновые белки приобретают большой отрицательный заряд и отваливаются от ДНК • Ацетилирование гистонов также вносит отрицательный заряд, ослабляя взаимодействие ДНК-нуклеосома
Принцип работы “гистонового кода” • Аминокислотный остаток в гистоне • Модифицирующий фермент • Белок, который “воспринимает” модификацию
Наследование гистонового кода • Во время репликации нуклеосомы разбираются на димеры и удаляются с ДНК, а затем собираются на ДНК вновь. • Для двух дочерних цепей требуется в два раза больше нуклеосом. • Часть нуклеосомы во время репликации собирается по полуконсервативному принципу (например, если один димер H 3 H 4 «старый» , то второй – вновь синтезированный). • Вновь синтезированные гистоны будут модифицироваться по образцу «старых» .
Часть 3. Эпигенетика
Эпигенетические модификации Модификации гистонов Модификации ДНК Модификации негистоновых белков хроматина Изменение статуса транскрипции
Изменения Генетические • Как правило необратимые (мутации) • Изменения первичной структуры ДНК • Стабильно наследуемые Эпигенетические • Как правило обратимые • Не затрагивают изменений первичной структуры ДНК • Бывают долговременные и кратковременные • Множество взаимосвязанных механизмов • Могут возникать как случайно, так и специфическим образом в ответ на определенные изменения среды Эпимутация • Предполагается, что эпимутации возникают в 100 раз чаще, чем генетические мутации
Эпимутация Тот же самый ген но различная скрученность хвоста PLo. S Biol 1: 3 (2003)
Первое «полногеномное» исследование эпигенома человеческих клеток Расшифрован эпигеном эмбриональных стволовых клеток человека и клеток соединительной ткани легких (фибробластов). Эпигеном – совокупность состояний метилирования генома и модификаций гистонов
Взгляд на эпигеном
Исследование эпигенома • Исследование 80 пар однояйцевых близнецов в возрасте 3 -74 года • Чем старше исследуемая пара, тем больше разница в их профилях метилирования и ацетилирования гистонов, что приводило в существенной разнице в паттерне экспрессии генов
Эпигенетика и клонирование При клонировании трехцветной кошки никогда не получится кошка идентичного окраса, так как рисунок определяется случайной пятнистостью и случайной инактивацией одного из аллелей гена, определяющего окраску (черный/коричневый), в Х-хромосоме Имя кошки Сиси (“cc”) от слова “copycat”…
Эпигенетика и канцерогенез В опухолевых клетках паттерн эпигенетических модификаций значительно отличен от такового в нормальных клетках
Эпигенетика и старение • Чем длиннее характерная продолжительность жизни у вида животного, тем медленнее снижается у этого вида уровень метилирования с возрастом • Формирование аберрантных паттернов метилирования: гипометилирование в стареющих клетках и тканях (в целом) но: гиперметилирование Cp. G-островков в стареющих клетках и тканях • Такие же разнонаправленные изменения метилирования характерны для раковых клеток 88 сайтов около 80 генов для которых степень метилирования высоко коррелировала с возрастом
Эпигенетика и старение Интересный факт: • Рабочая пчела живет 6 недель, а пчеломатка – 6 лет. • Генетически они идентичны. Различаются только тем, что будущую пчеломатку во время развития кормят маточным молочком на несколько дней больше, чем обычную рабочую пчелу. • В результате у представителей этих пчелиных каст формируются несколько отличные эпигенотипы. И, несмотря на внешнее и биохимическое подобие, длительность их жизни различается в 50 раз!
Уровни эпигенетической регуляции 1. ДНК (геном) 2. РНК (транскриптом) регуляторные мотивы пре-м. РНК, антисмысловые РНК, нетранслирующиеся РНК, микро РНК, двухцепочечные РНК 3. Белки (протеом) метилирование, повторяющиеся последовательности, мутации отдаленных регуляторных элементов, транспозиции генетического материала метилирование/деметилирование лизина 4 и 9 гистона Н 3, ацетилирование/деацетилирование гистонов ?
Посттранскрипционная регуляция экспрессии генов эукариот Посттранскрипционная регуляция включает в себя механизмы контролирующие или регулирующие м. РНК после синтеза. • Альтернативный сплайсинг • Скорость транспорта м. РНК через ядерную мемрану • Время жизни м. РНК • РНК-РНК взаимодействия
Время жизни РНК • Анализ альтерантивных изоформ генов дрожжей показал среди них высокую гетерогенность времени жизни. • Было найдено 560 стабилизирующих м. РНК элементов и 851 дестабилизирующих • Одним из таких элементов, широко встречающимся среди м. РНК оказалась poly. U последовательность недалеко от 3’ конца, приводящая к образованию вторичной структуры с poly. A хвостом. Global Analysis of m. RNA Isoform Half-Lives Reveals Stabilizing and Destabilizing Elements in Yeast. Joseph V. Geisberg, Zarmik Moqtaderi, Xiaochun Fan, Fatih Ozsolak and Kevin Struhl. Cell, Volume 156, Issue 4, 812 -824, 13 February 2014
Новый класс ce. RNA • Если одна mi. RNA может регулировать экспрессию сотен РНК, то экспрессия этих РНК оказывается связанной • ce. RNA – competitive endogenous RNA – конкурентные эндогенные РНК
Новый класс ce. RNA
Новый класс ce. RNA
Новый класс ce. RNA
RNA-mediated gene activation • Авторами было впервые показано, что при использовании si. RNA комплементарной промоторному участку приводит к увеличению экспрессии гена в несколько раз • В то же время только использование неполностью комплементарной si. RNA (MM – mismatched) не имела такого действия • Также было показано, что сей процесс происходит при участии белка Ago 2 Involvement of argonaute proteins in gene silencing and activation by RNAs complementary to a non-coding transcript at the progesterone receptor promoter. Yongjun Chu, Xuan Yue, Scott T. Younger, Bethany A. Janowski and David R. Corey. Nucl. Acids Res. (2010) 38 (21): 7736 -7748.
RNA-mediated gene activation Два предположительных механизма – активация (A) и дерепрессия (B)
RNA-mediated gene activation Не только с помощью si. RNA, но и посредством mi. RNA В другом исследовании было показано что mi. R-205 транскрипционно активирует гены супрессоры опухолевого роста IL-24 и IL-32, через комплементарные последовательности в их промоторах, что приводит к увеличению экспрессии как на уровне м. РНК так и на уровне белка. Micro. RNA-205 -directed transcriptional activation of tumor suppressor genes in prostate cancer. Majid S, Dar AA, Saini S, Yamamura S, Hirata H, Tanaka Y, Deng G, Dahiya R. Cancer 2010; 116: 5637 -49;
Природные антисмысловые транскрипты Парой смысловой-антисмысловой транскрипты называется пара чьи последовательности м. РНК комплементарны. Цис-антисмысловой транскрипт экспрессируется в одном геномном локусе со смысловым транскриптом. Транс-антисмысловой транскрипт экспрессируется с другого геномного локуса чем смысловой транскрипт. цис-ПАТ транс-ПАТ
Перекрывающиеся природные антисмысловые транскрипты Сходящиеся (конец к концу) Расходящиеся (голова к голове) Неперекрывающиеся природные антисмысловые транскрипты Более 70% цис-ПАТ имеют сходящийся тип (перекрывание 3’ концов), в то время как только 15% имеют расходящийся тип. Оставшиеся 15% принадлежат ПАТ с полным перекрыванием или с отсутствием такового (интронные). Ориентация ПАТ конец к концу является в 5 раз более эволюционно консерватиной.
Встречаемость цис-ПАТ в нескольких эукариотических организмах Виды Перекрывающиеся транскрипты Всего транскриптов Доля (%) Human 5, 880 26, 741 22 Mouse 12, 519 43, 553 29 Rat 548 11, 332 5 Chicken 356 7, 390 5 Drosophila 2, 054 13, 379 15 Rice 1, 374 20, 477 7 Arabidopsis 2, 680 29, 993 9 Nematode 76 14, 406 0. 5 Yeast 610 7, 598 8
Природные антисмысловые транскрипты смысловой – sense условное деление антисмысловой - antisense Фактически мы имеем РНК-РНК взаимодействие, которое может иметь функциональное значение, а может и не иметь его.
Транскрипционная интерференция РНК маскирование Двух-цепочечное РНК-зависимое замалчивание Моделирование хроматина Негативная регуляция Механизмы регуляции экспрессии генов с помощью ПАТов
Позитивная регуляция антисмысловыми транскриптами • Антисмысловой транскрипт к гену Zeb 2 маскирует сайт сплайсинга и приводит к удержанию интрона в пре-м. РНК смыслового гена, что изменяет характер инициации трансляции и сопровождается значительной ее активацией. [Beltran M, Puig I, Peña C, García JM, Alvarez AB, Peña R, Bonilla F, de Herreros AG. A natural antisense transcript regulates Zeb 2/Sip 1 gene expression during Snail 1 -induced epithelial-mesenchymal transition. Genes Dev. 2008 Mar 15; 22(6): 756 -69. ] • Стабилизация или активация экспрессии смыслового транскрипта p 53 с помощью антисмысловой РНК Wrap 53. Показано что in vivo формирование дуплекса между смысловым и антисмысловым транскриптами в области 5′-нетранслируемой области м. РНК TP 53, что вызывает как транскрипционную, так и трансляционную активацию экспрессии смыслового гена p 53. Нокдаун Wrap 53 ведет к значительному снижению уровня смысловой м. РНК и супрессии активации белка p 53 при повреждении ДНК. И наоборот, при гиперэкспрессии Wrap 53 повышается уровень м. РНК смыслового гена, и клетки становятся более чувствительны к p 53 -опосредованному апоптозу. [Mahmoudi S, Henriksson S, Corcoran M, Méndez-Vidal C, Wiman KG, Farnebo M. Wrap 53, a natural p 53 antisense transcript required for p 53 induction upon DNA damage. Mol Cell. 2009 Feb 27; 33(4): 462 -71. ]
Изучение принципов регуляции антисмысловыми транскриптами Антисмысловая регуляция Негативная Позитивная AS↑ ═> S↓ AS↑ ═> S ↑ Отсутствие
Транс-антисмысловая регуляция цис-ПАТ транс-ПАТ
Встречаемость транс-ПАТ в нескольких эукариотических организмах
Некодирующая TINCR РНК • При исследовании транскриптома клеток предшественников и дифференцированных кератиноцитов была найдена linc. RNA меняющая экспрессию в 150 раз. • TINCR находится на 19 хромосоме, состоит из 3 экзонов общей длинной 3, 7 Кб. • Для РНК TINCR были сделаны эксперименты по pull-down и найдено 1814 взаимодействующих РНК и белок STAU 1, известный как РНК-связывающий белок. • Также был проведён нокдаун TINCR и найдено 419 генов изменивших экспрессию более чем в 2 раза. Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR. Kretz M, Siprashvili Z, Chu C, Webster DE, Zehnder A, Qu K, Lee CS, Flockhart RJ, Groff AF, Chow J, Johnston D, Kim GE, Spitale RC, Flynn RA, Zheng GX, Aiyer S, Raj A, Rinn JL, Chang HY, Khavari PA. Nature. 2013 Jan 10; 493(7431): 231 -5.
Методология pull-down экспериментов
Некодирующая TINCR РНК • Таким образом, был выявлен первый РНК-интерактом для РНК TINCR • Интересно, что пересечение между РНК выловленными (1814) и РНК изменившими экспрессию при нокдауне TINCR (419), составили 56 генов. Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR. Kretz M, Siprashvili Z, Chu C, Webster DE, Zehnder A, Qu K, Lee CS, Flockhart RJ, Groff AF, Chow J, Johnston D, Kim GE, Spitale RC, Flynn RA, Zheng GX, Aiyer S, Raj A, Rinn JL, Chang HY, Khavari PA. Nature. 2013 Jan 10; 493(7431): 231 -5.
Некодирующая p 21 РНК • При поиске генов изменяющих экспрессию при различных условиях индукции p 53 у мыши было найдено около 40 linc. RNA • Одна из них p 21 – содержала 2 экзона длинной 3. 1 Kb. • Экспериментами pull-down был найден белокрепрессор hn. RNP-K связывающийся с р21 • Путем делеционного анализа был найден участок в 780 нуклеотидов в 5’-конца необходимый для связывания с hn. RNP-K. 280 нуклеотидов в нём обладают высокой консервативность и формируют стабильную вторичную структуру. • Серией экспериментов показано что p 21 взаимодействуя с hn. RNP-K подавляет экспрессию около 1, 5 тысячи генов, с промоторами которых способен связываться с hn. RNP-K A large intergenic noncoding RNA induced by p 53 mediates global gene repression in the p 53 response. Huarte M, Guttman M, Feldser D, Garber M, Koziol MJ, Kenzelmann-Broz D, Khalil AM, Zuk O, Amit I, Rabani M, Attardi LD, Regev A, Lander ES, Jacks T, Rinn JL. Cell. 2010 Aug 6; 142(3): 409 -19.
Некодирующая p 21 РНК • На клетках He. La было показано что linc-p 21 взаимодействует с Hu. R, увеличивая скорость её деградации. Hu. R является широко-экспрессирующимся РНКсвязывающим белком, способным влиять на клеточную пролиферацию, выживание, канцерогенез, стресс и иммунный ответ. • Эксперименты по pull-down показали что с p 21 взаимодействует также белок Ago 2, который также участвует с Hu. R в деградации p 21. • Зная, что Hu. R участвует в репрессии b-катенина (CTNNB 1) и Jun. B (JUNB), авторы решили проверить участие в этом р21. Биоинформатический анализ показал, что р21 имеет с b-катенином 15 комплементарных участков а Jun. B – 8, размером от 15 до 33 нуклеотидов, что подтвердили эксперименты по pull-down. • Эксперименты по pull-down выявили два трансляционных репрессора - Rck и FMRP. В дальнейшем для Rck было показано, что в присутствии p 21 белок Rck ингибирует трансляцию b-катенина и Jun. B. Linc. RNA-p 21 suppresses target m. RNA translation. Yoon JH, Abdelmohsen K, Srikantan S, Yang X, Martindale JL, De S, Huarte M, Zhan M, Becker KG, Gorospe M. Mol Cell. 2012 Aug 24; 47(4): 648 -55.
Некодирующая p 21 РНК Linc. RNA-p 21 suppresses target m. RNA translation. Yoon JH, Abdelmohsen K, Srikantan S, Yang X, Martindale JL, De S, Huarte M, Zhan M, Becker KG, Gorospe M. Mol Cell. 2012 Aug 24; 47(4): 648 -55.
Трансляционная регуляция экспрессии генов эукариот • Трансляционная регуляция включает в себя механизмы предотвращающие синтез белка. • Как правило, очень часто речь идет о белковых факторах необходимых для трансляции • Предотвращение рибосом от связывания с м. РНК • Факторы инициации трансляции
Посттрансляционная регуляция экспрессии генов эукариот • Посттрансляционная регуляция включает в себя механизмы действующие на белок после его синтеза. • Активация белков • Некоторые белки не активны после синтеза, они должны пройти пострансляционнии модификации • Много белков активируются после фосфорилирования • Feedback Control • Некоторые ферменты в метаболических путях могут быть негативно ингибированы продуктами этого же пути • Деградация белков
Скачать презентацию Молекулярная биология Лекция 12 Регуляция Скоблов Михаил Юрьевич
12. Regulation.pptx