Молекулярная биология l l достижения; методика получения трансгенных организмов.
Молекулярная биология комплекс биологических наук, изучающих механизмы хранения, передачи и реализации генетической информации, строение и функции нерегулярных биополимеров (белков и нуклеиновых кислот).
История развития Дата рождения молекулярной биологии - апрель 1953 года. В английском журнале «Nature» появилась статья Джеймса Д. Уотсона и Фрэнсиса Крика с предложением пространственной модели молекулы ДНК. Основанием для построения этой модели послужили работы по рентгеноструктурному анализу, в которых участвовали также Морис Х. Ф. Уилкинсон и Розалинда Франклин.
В 1928 году Фредерик Гриффит впервые показал, что экстракт убитых нагреванием болезнетворных бактерий может передавать признак патогенности неопасным бактериям. Исследование трансформации бактерий в дальнейшем привело к очистке болезнетворного агента, которым, вопреки ожиданиям, оказался не белок, а нуклеиновая кислота. Сама по себе нуклеиновая кислота не опасна, она лишь переносит гены, определяющие патогенность и другие свойства микроорганизма.
В 50 -е годы XX век - показано, что у бактерий существует примитивный половой процесс, они способны обмениваться внехромосомной ДНК, плазмидами. Открытие плазмид, как и трансформации, легло в основу распространенной в молекулярной биологии плазмидной технологии. Начало XX века - обнаружение вирусов бактерий, бактериофагов. Фаги тоже могут переносить генетический материал из одной бактериальной клетки в другую. Заражение бактерий фагами приводит к изменению состава бактериальной РНК. Если без фагов состав РНК сходен с составом ДНК бактерии, то после заражения РНК становится больше похожа на ДНК бактериофага. Тем самым было установлено, что структура РНК определяется структурой ДНК. В свою очередь, скорость синтеза белка в клетках зависит от количества РНКбелковых комплексов. Так была сформулирована центральная догма молекулярной биологии: ДНК ↔ РНК → белок.
ДНК
Начало XXI века - получены данные о первичной структуре всей ДНК человека и целого ряда других организмов, наиболее важных для медицины, сельского хозяйства и научных исследований, что привело к возникновению нескольких новых направлений в биологии: геномики, биоинформатики и др.
Достижения: раскрытие структуры и механизма биологической функции ДНК, всех типов РНК и рибосом, раскрытие генетического кода; открытие обратной транскрипции, т. е. синтеза ДНК на матрице РНК; изучение механизмов функционирования дыхательных пигментов; открытие трёхмерной структуры и её функциональной роли в действии ферментов, принципа матричного синтеза и механизмов биосинтеза белков; раскрытие структуры вирусов и механизмов их репликации, первичной и, частично, пространственной структуры антител;
изолирование индивидуальных Генов, химический, а затем биологический (ферментативный) синтез гена, в том числе человеческого, вне клетки; перенос генов из одного организма в другой, в том числе в клетки человека; стремительно идущая расшифровка химической структуры возрастающего числа индивидуальных белков, главным образом ферментов, а также нуклеиновых кислот; обнаружение явлений «самосборки» некоторых биологических объектов всё возрастающей сложности, начиная от молекул нуклеиновых кислот и переходя к многокомпонентным ферментам, вирусам, рибосомам и т. д. ; выяснение аллостерических и других основных принципов регулирования биологических функций и процессов.
Методика получения трансгенных организмов Трансге нный органи зм — живой организм, в геном которого искусственно введен ген другого организма.
Ген вводится в геном хозяина в форме так называемой «генетической конструкции» — последовательности ДНК, несущей участок, кодирующий белок, и регуляторные элементы (промотор, энхансер и пр. ), а также в некоторых случаях элементы, обеспечивающие специфическое встраивание в геном (например, т. н. «липкие концы» ). Генетическая конструкция может нести несколько генов, часто она представляет собой бактериальную плазмиду или ее фрагмент.
Цель создания трансгенных организмов - получение организма с новыми свойствами. Клетки трансгенного организма производят белок, ген которого был внедрен в геном. Новый белок могут производить все клетки организма (неспецифическая экспрессия нового гена), либо определенные клеточные типы (специфическая экспрессия нового гена). Создание трансгенных организмов используют: в научном эксперименте для развития технологии создания трансгенных организмов, для изучения роли определенных генов и белков, для изучения многих биологических процессов; огромное значение в научном эксперименте получили трансгенные организмы с маркерными генами (продукты этих генов с легкостью определяются приборами, например зелёный флуоресцентный белок, визуализируют с помощью микроскопа, так легко можно определить происхождение клеток, их судьбу в организме и т. д. ); в сельском хозяйстве для получения новых сортов растений и пород животных; в биотехнологическом производстве плазмид и белков.
Ключевым этапом в технологии создания трансгенных организмов является трансфекция (в рус. лит-ре: «трансгенез» , «трансгеноз» и «трансгенология» ) — внедрение ДНК в клетки будущего трансгенного организма. В настоящее время разработано большое количество методов трансфекции.
Трансфекция Процесс введения нуклеиновой кислоты в клетки человека и животных невирусным методом. Аналогичный процесс в отношении бактерий, дрожжей и растений называется трансформация. Трансфекция обычно включает образование в плазматической мембране отверстий через которые внутрь клетки может проникать внеклеточный материал. Трансфицирован может быть генетический материал, такой как ДНК или РНК, а также белки, например, антитела. Для трансфекции часто используют сильное электрическое поле (электропорация) или электростатически заряженные липиды, способные к образованию липосом, структур, которые сливаются с плазматической мембраной, выбрасывая внутрь клетки заключенный в них материал. Известны и другие методы трансфекции.
Первоначальный смысл слова трансфекция: инфекция для трансформации, т. е. введение в клетки вирусного генома, в результате чего начинается инфекция. Но, поскольку в приложении к человеку и животным термин трансформация имеет иное значение (генетические изменения, позволяющие вести клетки в культуре в течение длительного времени, преодолевая лимит Хейфлика, что типично, например, для раковых клеток), термин трансфекция было предложено использовать как замену термину трансформация в смысле изменения фенотипа путем введения чужеродной нуклеиновой кислоты.
Методы трансфекции Материалы, используемые для трансфекции, относятся к трем основным типам: микрочастицы, катионные полимеры и липосомы.
Один из самых дешевых и наименее надежных методов является кальций-фосфатная трансфекция, изобретенная в 70 -х годах ХХ века. Изотонический раствор, содержащий буфер HEPES, фосфат и ДНК, смешивают с хлористым кальцием. Образуется осадок из частиц фосфата кальция и ДНК, размер которых лежит в нанометровом диапазоне. Суспензию добавляют к культуре клеток, которые поглощают частицы (как именно, авторы не уточняли). Лучше всего такая трансфекция проходит с эмбриональными клетками почки человека линии 293, но с несколько меньшей эффективностью трансфицируются и многие другие линии.
Более эффективен метод, в котором используют липосомы, структуры, много меньшие по размерам, чем клетки, состоящие из липидной мембраны, окружающей ДНК в водной фазе. Их строение напоминает строение клеток, которые тоже окружены фосфолипидной мембраной. Липосомы могут сливаться с клеточной мембраной, после чего их внутреннее пространство сливается с содержимым клеток. Для образования липосом обычно используют положительно заряженные липиды, т. к. ДНК и клеточные фосфолипиды заряжены отрицательно, а частицы с разным электростатическим зарядом притягиваются друг к другу. Еще один метод трансфекции - использование положительно заряженных водорастворимых полимеров, таких как ДЭАЭ-декстран или полиэтиленимин. Отрицательно заряженная ДНК связывает поликатионы, и образовавшийся комплекс поглощается клетками путем эндоцитоза.
ДНК может быть также введена в клетки путем микроинъекции или с помощью "генной пушки". Последняя использует микрочастицы инертного твердого вещества (обычно золота), к которым пришита ДНК. Среди прочих методов трансфекции можно упомянуть электропорацию, нуклеофекцию, тепловой шок, использование магнитных частиц, и множество коммерческих реагентов, распространяемых изготовителями продукции для научных исследований.
Скачать презентацию Молекулярная биология l l достижения методика получения трансгенных
Молекулярная биология.ppt