Молекулярна діягностика: наука, ворожба чи факт життя? Від Гіппократа до персоналізованої медицини Др. Юрій Мончак Університет Меꥳл Факультет Медицини і Департамент Експериментальної Медицини Монтреаль, Канада Івано-Франківськ, Україна грудень 2013 р.
ДНК (дезоксирібонуклеїчна кислота) Меґа-молекула життя Трільйони клітин хромосоми Кожна клітина має: ґени 46 хромосомів (23 пари) 2 метри ДНК 3 більйони компонентів (A, C, G, T) ~ 20 -30, 000 ґенів кодують протеїни, які виконують всі функції життя клітини і організму клітина ДНК протеїна (білок)
Від ДНК до людини Ґенотип ~20 -30, 000 різних ґенів в кожній клітині диктує. . . 3 білійони компонентів ДНК в ядрі кожної клітини Фенотип т дук их про мічн ає е – ц іохе плив б в на ди них і яких Лю ин на т клі тем, сис кілля в до
ц = цукор (дезоксирібоз) ф = фосфат ц ц ф ф ц ц ф ф
ц = цукор (дезоксирібоз) ф = фосфат ц ф ц ф ц ф а а а g g t ц g c t t c c ф ц ф ц ф ц ф
ц = цукор (дезоксирібоз) ф = фосфат ц ф ц ф ц ф а а а g g t ц g c t t c c ф ц ф ц ф ц ф . . . agaaggcgatattgtctgaacctcg. . . tcttccgctataacagacttggagc. . .
Зміна в секвенції ґена може змінити форму і/або функцію протеїни Ґен людини #1 протеїна Ґен людини #2 Кодон змінений, протеїна ідентична Ґен людини #3 Кодон змінений, протеїна змінена або
Традиційна медицина: - фізичні ознаки (температура, біль, кольор шкіри) - морфологічні ознаки (пухлина, кровотеча, деформація) “tumor, calor, dolor, rubor” - фізіологічні ознаки (гематокрит, Ca++, цукор. . . )
Традиційна медицина: - фізичні ознаки (температура, біль, кольор шкіри) - морфологічні ознаки (пухлина, кровотеча, деформація) “tumor, calor, dolor, rubor” - фізіологічні ознаки (гематокрит, Ca++, цукор. . . ) Патологічні ознаки (розріз) - макроскопічна морфологія - мікроскопічна морфологія - маркери клітинної поверхні (CD 20, CD 3…
Традиційна медицина: - фізичні ознаки (температура, біль, кольор шкіри) - морфологічні ознаки (пухлина, кровотеча, деформація) “tumor, calor, dolor, rubor” - фізіологічні ознаки (гематокрит, Ca++, цукор. . . ) Патологічні ознаки (розріз) - макроскопічна морфологія - мікроскопічна морфологія - маркери клітинної поверхні (CD 20, CD 3… Поточна цитомерія (flow cytometry)
Молекуларна медицина: - суть фізичних, фізіологічних і цитологічних ознак
Молекуларна медицина: - суть фізичних, фізіологічних і цитологічних ознак Цитоґенетика - стан «інформативної бібліотеки» “Чи хтось не вкрав книжки, чи не роздер її, чи не поставив на злу полицю”
Молекуларна медицина: - суть фізичних, фізіологічних і цитологічних ознак Цитоґенетика - стан «інформативної бібліотеки» “Чи хтось не вкрав книжки, чи не роздер її, чи не поставив на злу полицю” Молекуларна діягностика “Чи хтось не вимазав літери, чи не витер слова, чи не замінив «так» на «ні» .
Видалення Головні роди мутацій
Видалення Дуплікація Головні роди мутацій
Видалення Дуплікація Головні роди мутацій Вставка
Видалення Дуплікація Головні роди мутацій Вставка Транслокація
17 15 t(15; 17)
Молекуларний підхід до мутацій: Др. Едвін Савтерн (Edward Southern) з університету Едінборо в Шкотляндії Southern, Edwin Mellor 1975. "Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis". Journal of Molecular Biology 98 (3): 503– 517.
“Савтерн блот”
Eco. RI мітка 6. 8 кп виділення 0. 3 кп Eco. RI мітка 6. 5 кп мітка 1. 5 кп 1. 9 кп 3. 1 кп електрофореза 2. 2 кп 1. 5 кп + 1. 9 кп
“Полімеризаційна ланцюгова реакція” Двоспіральна молекула ДНК
Двоспіральна молекула ДНК Фрагмент ДНК для аналізи + Якори (~ 20 нуклеотидів) Буфер Mg. Cl 2 Полімераза ДНK (“Taq polymerase”) Вода
Двоспіральна молекула ДНК 950 C, 30 сек Розділ двоспіралі на дві окремі молекули
Двоспіральна молекула ДНК 950 C, 30 сек Розділ двоспіралі на дві окремі молекули ~ 600 C, 30 сек Злука якорів
Двоспіральна молекула ДНК 950 C, 30 сек Розділ двоспіралі на дві окремі молекули ~ 600 C, 30 сек Злука якорів полімераза 720 C , 45 сек
Двоспіральна молекула ДНК 950 C, 30 сек Розділ двоспіралі на дві окремі молекули ~ 600 C, 30 сек Злука якорів полімераза 720 C , 45 сек Полімераза ДНК копіює кожну сторону
Двоспіральна молекула ДНК 950 C, 30 сек Повторити цикль 35 -45 разів Розділ двоспіралі на дві окремі молекули ~ 600 C, 30 сек Злука якорів полімераза 720 C , 45 сек Полімераза ДНК копіює кожну сторону
Експоненційна фаза Пересичена фаза (невповні експоненційна)
Фоликулярна лимфома
Проблема транслокації: фоликулярна лимфома
Ig. H Хром. 14 Хром. 18 Bcl-2
Ig. H Хром. 14 Хром. 18 Bcl-2
Ig. H Хром. 14 Bcl-2 Хром. 18 Bcl-2 t(14; 18) Ig. H
Ig. H Хром. 14 Bcl-2 Хром. 18 Bcl-2 t(14; 18) підсилення Ig. H
Ig. H Хром. 14 Bcl-2 Хром. 18 Bcl-2 Ig. H t(14; 18) підсилення Клітина безсмертна
Ізоляція ДНК ПЛР амплікон (присутний тільки у транслокації)
Bcl-2 Ig. H ПЛР амплікон
Bcl-2 Ig. H ПЛР амплікон Ig. H Bcl-2 відсутність амплікона
Bcl-2 Ig. H Bcl-2 ПЛР відсутність амплікона амплікон електрофореза - - + + - - M
амплікон ПЛР Ф 950 С = денатурація ДНК і мітки Г Флуоресцентна мітка злука мітки Ф Г Зміряти кількість флуоресцентного світла
Ґен ЮЯ Ґен АБ Ґен ЮЯ мут C A T C A C G A A T G A
Ґен ЮЯ T G C T Ґен АБ G T A G C A T C A C G A Ґен ЮЯ мут T A C T A T G A
А чому мені не відчитати ввесь ґенетичний код?
1987
2001
a c g t t g t c c c t g g g a t c a g a t t a c t g c c c c g a a a c g t g t a g g a g t c a ? c t g a g t a g g g a c c a t c g g a t g g a a c g t t t g a c c t g g t c g a c g g c t t t c g t t t g g g c a g a ? ? ?
Секвенування наступного покоління: - паралельне і одночасне секвенування мільйонів фраґментів
Секвенування наступного покоління: - паралельне і одночасне секвенування мільйонів фраґментів - кожний фраґмент кодований (bar code)
Секвенування наступного покоління: - паралельне і одночасне секвенування мільйонів фраґментів - кожний фраґмент кодований (bar code) - нема потреби ізолювати кожний індивідуальний фраґмент – можна всіх зібрати разом в один зразок
Секвенування наступного покоління: - паралельне і одночасне секвенування мільйонів фраґментів - кожний фраґмент кодований (bar code) - нема потреби ізолювати кожний індивідуальний фраґмент – можна всіх зібрати разом в один зразок - кожна позиція нуклеотида прочитана багато разів – це запевняє специфічність та сенситивність = «глибина відчитання»
Секвенування наступного покоління: - паралельне і одночасне секвенування мільйонів фраґментів - кожний фраґмент кодований (bar code) - нема потреби ізолювати кожний індивідуальний фраґмент – можна всіх зібрати разом в один зразок - кожна позиція нуклеотида прочитана багато разів – це запевняє специфічність та сенситивність = «глибина відчитання» - монтаж усіх відчитаних фраґментів автоматизований компютером = швидкість секвенування
Секвенування наступного покоління: - паралельне і одночасне секвенування мільйонів фраґментів - кожний фраґмент кодований (bar code) - нема потреби ізолювати кожний індивідуальний фраґмент – можна всіх зібрати разом в один зразок - кожна позиція нуклеотида прочитана багато разів – це запевняє специфічність та сенситивність = «глибина відчитання» - монтаж усіх відчитаних фраґментів автоматизований компютером = швидкість секвенування - можливість секвенувати цілий ґеном за кільканадцять годин!
Емульсійна ПЛР: Ґеномічна ДНК механічна фраґментація
Емульсійна ПЛР: Ґеномічна ДНК механічна фраґментація додаток адаптора
Емульсійна ПЛР: Ґеномічна ДНК механічна фраґментація додаток адаптора “код” адаптор
Емульсійна ПЛР: Ґеномічна ДНК механічна фраґментація додаток адаптора емульсія кульки з якорами
Емульсійна ПЛР: Ґеномічна ДНК механічна фраґментація додаток адаптора емульсія полімераза ДНК кульки з якорами
Емульсійна ПЛР: Ґеномічна ДНК механічна фраґментація додаток адаптора емульсія полімераза ДНК кульки з якорами c a g t нуклеотиди
Емульсійна ПЛР: Ґеномічна ДНК механічна фраґментація додаток адаптора t g емульсія a c полімераза ДНК a g t c кульки з якорами c a g t нуклеотиди
ампліфікація ПЛР t g c a
ампліфікація ПЛР t g c a
ампліфікація ПЛР t g c a
t a g c розбити везикул - денатурувати - відкинути однонитковий фраґмент
наладувати мікропланшету (одна кулька на кожну мікродірку)
c a g t - нуклеотиди додані почерзі - детекція променювання - мікродірки полоскані після кожної черги датчик світла
c a g t - нуклеотиди додані почерзі - детекція променювання - мікродірки полоскані після кожної черги датчик світла випромінювання світла
2013 Кошт секвенування цілого ґенома:
Nature, 2005 “The total genetic difference between humans and chimps, in terms of number of bases, sums to about 4% of the genome. ” «Повна ґенетична різниця між людиною і шимпанзе, беручи під увагу кількість нуклеотидів, співпадає з 4% ґенома. »
А що робить нас людиною ?
Від 1995 року, понад 1, 000 організмів були секвановані: - Перший секванований організм: Haemophilus influenzae (1995) - Перший евкаріотичний організм: Saccharomyces cerevisiae (1996) - Перший багатоклітинний організм: Caenorhabditis elegans (1998) - Перший ссавець: Homo sapiens (2001/2006), Mus musculus (2002)
Ну і що мені і моєму пацієнтові з цієї науки?
Доба персоналізованої медицини Як це все лікувати?
Принципи традиційної терапії: - Ракові клітини швидше множаться від нормальних клітин
Принципи традиційної терапії: - Ракові клітини швидше множаться від нормальних клітин 1. Хеміотерапія: Контрольована доза хемічних “трійливих” складників
Принципи традиційної терапії: - Ракові клітини швидше множаться від нормальних клітин 1. Хеміотерапія: Контрольована доза хемічних “трійливих” складників і/або 2. Радіотерапія: Променювання радіяції
“Chronic Myelogenous Leukemia” (CML): Хронічна мієлогенна левкемія - Хвороба гематологічних стовбурних клітин
“Chronic Myelogenous Leukemia” (CML): Хронічна мієлогенна левкемія - Хвороба гематологічних стовбурних клітин - Перший людський рак (левкемія) з чітко окресленою ґенетичною вадою
“Chronic Myelogenous Leukemia” (CML): Хронічна мієлогенна левкемія - Хвороба гематологічних стовбурних клітин - Перший людський рак (левкемія) з чітко окресленою ґенетичною вадою - 95% пацієнтів виявляють “Філядельфійський хромозом” t(9; 22)(q 34: q 11)
“Chronic Myelogenous Leukemia” (CML): Хронічна мієлогенна левкемія - Хвороба гематологічних стовбурних клітин - Перший людський рак (левкемія) з чітко окресленою ґенетичною вадою - 95% пацієнтів виявляють “Філядельфійський хромозом” t(9; 22)(q 34: q 11) - 99% пацієнтів виявляють химеричний ґен “BCR/ABL”
“Chronic Myelogenous Leukemia” (CML): Хронічна мієлогенна левкемія - Хвороба гематологічних стовбурних клітин - Перший людський рак (левкемія) з чітко окресленою ґенетичною вадою - 95% пацієнтів виявляють “Філядельфійський хромозом” t(9; 22)(q 34: q 11) - 99% пацієнтів виявляють химеричний ґен “BCR/ABL” Перша людська неоплазія, де молекуларна характеристика допровадила до раціонального розвитку терапії
Історичний розвиток терапії Arsenic Опромінення селезінки “Busulfan” “Hydroxyurea” Перещіплення стовбурових клітин Багатостороння хеміотерапія Інтерферон α 1865 1903 1953 1964 1975 1983 1999 2005
Історичний розвиток терапії Arsenic Опромінення селезінки “Busulfan” “Hydroxyurea” Перещіплення стовбурових клітин Багатостороння хеміотерапія Інтерферон α Imatinib 1865 1903 1953 1964 1975 1983 1999 2005
BCR/ABL Imatinib/Gleevec
Інші роди раків та їхні “Немезіди”: Рак Ціль/ґен Терапія Рак легенів (NSCLC) EGFR Gefitinib Erlotinib Рак кишки (GIST) c-KIT Imatinib Рак кишки (colon cancer) k-RAS Vectibix Erbitux Левкемія (AML) FLT 3 Lestaurtinib? Midostaurin? Меланома Левкемія (“hairy cell leukemia”) BRAF Vemurafenib
Quo vadis? Operor vos reputo ego teneo!* * “А біда його знає!”
Джерело стовбурових клітин: 2. Зрілі стовбурові клітини
Джерело стовбурових клітин: 2. Зрілі стовбурові клітини
Джерело стовбурових клітин: 2. Зрілі стовбурові клітини Частинно обмежений потенціял (multipotent)
Інші джерела стовбурових клітин: 3. фетус 4. амніон 5. пуповинна кров
Інші джерела стовбурових клітин: 3. фетус 4. амніон 5. пуповинна кров 6. індуковані плуріпотентні клітини (i. PS – induced pluripotent stem cells)
мишачі ембріонні клітини 1981 1988 1992 1998 2005 2006 2007 2010
вирощування мишачих ембріонів мишачі ембріонні клітини 1981 1988 1992 1998 2005 2006 2007 2010
гематопоіетичні стовбурові клітини в крові вирощування мишачих ембріонів мишачі ембріонні клітини 1981 1988 1992 1998 2005 2006 2007 2010
гематопоіетичні стовбурові клітини в крові вирощування мишачих ембріонів мишачі ембріонні клітини 1981 1988 людські ембріонні клітини ізольовані з мозку (Samuel Weiss) 1992 1998 2005 2006 2007 2010
ізоляція людських ембріонних клітин (James Thomson) гематопоіетичні стовбурові клітини в крові вирощування мишачих ембріонів мишачі ембріонні клітини 1981 1988 людські ембріонні клітини ізольовані з мозку (Samuel Weiss) 1992 1998 2005 2006 2007 2010
ізоляція людських ембріонних клітин (James Thomson) гематопоіетичні стовбурові клітини в крові вирощування мишачих ембріонів мишачі ембріонні клітини 1981 1988 перепрограмування дорослих ембріонічних клітин (Kevin Eggan) людські ембріонні клітини ізольовані з мозку (Samuel Weiss) 1992 1998 2005 2006 2007 2010
ізоляція людських ембріонних клітин (James Thomson) гематопоіетичні стовбурові клітини в крові вирощування мишачих ембріонів мишачі ембріонні клітини 1981 1988 людські ембріонні клітини ізольовані з мозку (Samuel Weiss) 1992 1998 перепрограмування дорослих ембріонічних клітин (Kevin Eggan) індуктовані стовбурові клітини (Shinya Yamanaka) 2005 2006 2007 2010
індуктовані стовбурові клітини трансплантовані у мишах ізоляція людських ембріонних клітин (James Thomson) гематопоіетичні стовбурові клітини в крові вирощування мишачих ембріонів мишачі ембріонні клітини 1981 1988 людські ембріонні клітини ізольовані з мозку (Samuel Weiss) 1992 1998 перепрограмування дорослих ембріонічних клітин (Kevin Eggan) індуктовані стовбурові клітини (Shinya Yamanaka) 2005 2006 2007 2010
індуктовані стовбурові клітини трансплантовані у мишах ізоляція людських ембріонних клітин (James Thomson) гематопоіетичні стовбурові клітини в крові вирощування мишачих ембріонів мишачі ембріонні клітини 1981 1988 людські ембріонні клітини ізольовані з мозку (Samuel Weiss) 1992 1998 перепрограмування дорослих ембріонічних клітин (Kevin Eggan) перепрограмування дорослих дифиренціованих клітин у ембріонічні (James Thomson Shinya Yamanaka) індуктовані стовбурові клітини (Shinya Yamanaka) 2005 2006 2007 2010
індуктовані стовбурові клітини трансплантовані у мишах ізоляція людських ембріонних клітин (James Thomson) гематопоіетичні стовбурові клітини в крові вирощування мишачих ембріонів мишачі ембріонні клітини 1981 1988 людські ембріонні клітини ізольовані з мозку (Samuel Weiss) 1992 1998 патент перших індуктованих стовбурових клітин перепрограмування дорослих ембріонічних клітин (Kevin Eggan) перепрограмування дорослих дифиренціованих клітин у ембріонічні (James Thomson Shinya Yamanaka) індуктовані стовбурові клітини (Shinya Yamanaka) 2005 2006 2007 2010
Sir John B. Gurdon Shinya Yamanaka
1. Морфологічно ідентичні до ембріонних стовбурових клітин Oct 3/4 Klf 4 Sox 2 c-Myc βgeo
1. Морфологічно ідентичні до ембріонних стовбурових клітин 1. Диференціюються у різні роди клітин (неврони, кишкові, гематопоієтичні. . . ) Oct 3/4 Klf 4 Sox 2 c-Myc βgeo
1. Морфологічно ідентичні до ембріонних стовбурових клітин 1. Диференціюються у різні роди клітин (неврони, кишкові, гематопоієтичні. . . ) 3. Творять тератокарсиноми в «голих мишах» (“nude mice”) Oct 3/4 Klf 4 Sox 2 c-Myc βgeo
1. Морфологічно ідентичні до ембріонних стовбурових клітин 1. Диференціюються у різні роди клітин (неврони, кишкові, гематопоієтичні. . . ) 3. Творять тератокарсиноми в «голих мишах» (“nude mice”) Oct 3/4 4. розвиваються у різні органи після імплантації в ембріони Klf 4 Sox 2 c-Myc βgeo
1. Морфологічно ідентичні до ембріонних стовбурових клітин 1. Диференціюються у різні роди клітин (неврони, кишкові, гематопоієтичні. . . ) 3. Творять тератокарсиноми в «голих мишах» (“nude mice”) Oct 3/4 4. розвиваються у різні органи після імплантації в ембріони Klf 4 Sox 2 c-Myc βgeo 5. твоять ґамети – нові покоління мишей
Доказали, що кожна диференціована клітина в організмі може бути перепрограмована у стовбурову клітину. . .
Доказали, що кожна диференціована клітина в організмі може бути перепрограмована у стовбурову клітину. . . яка послідовно може дати почин будь-якій іншій диференціованій клітині
Медичне пристосування індуктованих стовбурових клітин (“i. PS”):
Медичне пристосування індуктованих стовбурових клітин (“i. PS”):
Медичне пристосування індуктованих стовбурових клітин (“i. PS”):
Медичне пристосування індуктованих стовбурових клітин (“i. PS”):
Медичне пристосування індуктованих стовбурових клітин (“i. PS”):
Медичне пристосування індуктованих стовбурових клітин (“i. PS”):
Медичне пристосування індуктованих стовбурових клітин (“i. PS”):
Медичне пристосування індуктованих стовбурових клітин (“i. PS”):
Медичне пристосування індуктованих стовбурових клітин (“i. PS”):
«Відважний, новий світ» Алдус Гакслі
А що, коли я себе ду-у-у-же люблю? ☼ 5 липня 1996 † 14 лютого 2003
Ian Wilmut Keith Campbell The Roslin Institute
Досі клоновані звірята: Короп Кіт Корова Сарна Пес Тхір Жаба Дрософіл Ґавр (“gaur”)* Коза Кінь Миш Муфлон Мул Свиня Піринейський ібекс* Заяць Щур Малпа (Резус) Вівця Буйвіл (“water buffalo”) Вовк * загинув внедовзі після народження
У Познані, Польща, “відбудовують” европейського зубра. . .
«Клонування людини вже ближче, ніж ви собі уявляєте»
Dr. Samuel Wood 2008
22 -го квітня 2009 року появилася така новина. . .
Др. Панагіотіс Завос - Клонував 14 людських ембріонів - Пересадив 11 з них в лоно 4 -ох жінок, які свідомо згодилися виносити клонованих дітей. Процес клонування був сфільмований незалежним фільмовим режисером, який поручив, що процес автентичний. Сурогатні матері мали надію бути першими жінками, які виносили клонованих людей, спеціяльно створених для репродукції.
Конференсія в Оксфорді
Усі ембріони загинули, але процес повторюється Експериментальна фузія коров’ячого ооцита і диференціованих людських клітин В додатку, проводиться ін’єкція ядра із заморожених клітин мертвої особи, щоби «привести назад до життя» померлу жінку.
А що б Завос зробив, коли б побачив, що імплантований фетус має ґенетичну ваду? «Ми це не рішаємо. . . це справа батьків. . . «Це є медицина – це не політика. . . це не є релігія. »
Royal Victoria Hospital
Mc. Gill Cancer Center
Redpath Museum
Mc. Gill Genome Center
Strathcona School of Music
Скачать презентацию Молекулярна діягностика наука ворожба чи факт життя Від
2013-12 I-Frankivsk molecular presentation.pptx