МОЛЕКУЛАЛЫҚ ДИАГНОСТИКА Негізгі сұрақтары 1. Молекулалық диагностиканың жалпы сипаттамасы 2. ДНҚ-диагностика - Гибридизациялық зондтар Безгектің диагностикасы Анықтау әдістері ДНҚ-нысананы табу хемилюминесцентті әдіс. 3. Генетикалық аурулардың молекулалық диагностикасы. 4. Иммунноферменттік әдіс 5. Энзимодиагностика
Ауруды дұрыс емдеу үшін білу керек: l l l аурудың табиғаттын, аурудың себебін, ауруға байланысты молекулалық деңгейдегі биохимиялық өзгерістерін. Аурудың профилактикасы мен емдеу нәтижелері l l ауруды қоздыратын себебін, аурудың түрін ерте кезеңінде және нақты анықтауына байланысты.
Диагностика әдістің алдына қоятын талаптар - Молекула-нысана жөнінде әдістің ерекшелігі жоғары. - Әдістің сезімталдығы жоғары, заттардың өте төмен мөлшерін анықтау мүмкін. - Әдістің нұсқауы оңай және алынған нәтижелері бір мағыналы. Қазіргі күнде әдеттегі лабораториялық әдістермен бірге молекулалық диагностиканы кең пайдаланады.
Молекулалық диагностика – геннің денгейінде асырылатын диагностика. Генодиагностика жүргізгенде зертейді ақуыздарды (гемоглобин, альфа 1 антитрипсин т. б. ), РНК немесе ДНҚ. Негізгі әдіс – ДНҚ-ны зерттеу. Генодиагностикада пайдаланатын тәсілдері: - рекомбинация әдістерді көмегімен гендерді және ДНҚ фрагменттерін клондау; - ДНҚ фрагменттердің бірізділігін анықтау; - нуклеин қышқылдардың гибридизациясы; - рестрикциялық сайтардың идентификациясы; - ПЦР әдісті пайдаланып ДНК амплификациясы; - ақуыз өнімін in vitro талдау үшін ДНК транскрипция мен трансляция Әдетте бірнеше әдістерді пайдаланады, бастапқы материал ретінде м. РНҚ пайдаланады (ДНҚ-ны емес).
ДНҚ-диагностика Тұқым қуалаушылық генетикалық ауру ерекше геннің зақымданауына байланысты. ДНҚ молекуласының бір сегментінің нуклеотидтердің кезектесуі ағзаның бір биологиялық белгісін белгілейді, сондықтан аурудың диагностикалық маркері ретінде болу мүмкін. Нуклеин қышқылдарының гибридизациясын негізіне алған әдісте негізгі компоненттері: l l ДНҚ-зонд, РНҚ-зонд.
ДНК-диагностиканың негізіне молекулалық биологияның 3 негізгі принципы алынған: 1. ДНҚ молекуласының денатурация-ренатурациясы молекулы ДНК, 2. 20 -25 нуклеотид ұзындығы олигонуклеотид зондардың праймермен әрекеттесуі, 3. Комплементарлы әрекеттесуі А - Т, Г – Ц.
ДНҚ диагностикада пайдаланатын әдістері: - полимеразалы тізбекті реакция - лигазалы тізбекті реакция. ПЦР технология ДНҚ-ның ерекше фрагментерінің копияларын көбейтуіне негізделінеді. ПЦР(ПТР) технология жұқпалы аурулардың жеке клеткаларын табуға мүмкіндік береді. ПЦР әдістің кезеңдері *клиникалық үлгіден ДНҚ (РНҚ) бөліп алу; *ДНҚ-ның ерекше фрагменттерінің амплификациясы; *амплификация өнімдерін анықтау.
Полимеразалық тізбекті реакцияның этаптары
ДНҚ-диагностика әдістің жалпы сатылары: - Мембраналық фильтріне бір тізбекті ДНҚ-нысананы байланыстырады. - Бір тізбекті таңбаланған ДНҚ-зонды қондырады. Ортаның белгілі жағдайында (температура, иондық күші) ДНҚ-зонд ДНҚ-нысанамен қосарланады. - Фильтрді жуып таңбаланған байланыспаған ДНҚ-зондты кетіреді. - Зонд-нысана гибридті молекулаларын анықтайды.
Гибридизациялық зонд ретінде пайдаланады: - ДНҚ немесе РНҚ молекулаларын, - ұзын (100 нуклеотидтен астам) немесе қысқа (50 нуклеотидтен төмен) полинуклеотидтерді, - химиялық синтездің өнімін, - клонданған генді, - клонданған геннің бөлігін. ДНҚ- мен РНҚ-зондтар бір ғана нуклеотидтік тізбекпен будандастырылу керек. Зондтың көмегімен айырып тануға болады • екі немесе одан да көп тұқымдастардың түрлерін, • бір түрдің алуан штамдарын • әр түрлі гендерді.
Гибридизация зондтарды алу әдіс: - патогенді микроорганизмнің ДНҚ-сын эндонуклеазаның көмегімен ыдыратады, - плазмидалық векторда клондайды, - патогенді және қалыпты штамдардың геномды ДНҚ-ны пайдаланып рекомбинантты плазмидалардың скринингін жүзеге асырады.
Патогенді штамның ДНҚ-сымен ғана гибридизацияланған бөлігі бар плазмидалар түр ерекшелікті зонд негізін құрайды. Әр түрлі ағзалардан бөлініп алынған және модельді ДНҚ-ларымен зондты будандастырады. Гибридті молекулаларын зерттейді, нәтижесінде анықтайды: зондтың ерекшелігін, зондтың сезімталдығын. Гибридизация әдісінің көмегімен патогенді микроорганизмдердің көбісін анықтауға болады. 100 -ден астам түрлі ДНҚ-зондтар алынып сипатталған.
ДНҚ-зондтардың көмегімен анықтайды: l бактериялардың, l вирустардың, l паразит қарапайымдылардың патогенді штамдарын. ДНҚ-зонд көмегімен адамда бактериялық жұқпаларға себеп болатын микроорганизмдерді анықтайды: - Legionella pneumophilla (тыныс алу жүйесінің ауруы), - Salmonella typhi (тағамнан улану), - Campylobacter hyointestinalis (гастрит), - Escherichia coli (асқазан мен ішектің қабынуы).
Безгектің диагностикасын жүргізеді: қан жағындысының микроскоптық зерттеуді. Бұл әдіс тиімді, бірақ көп еңбекті және ұзақ уақытты қажет етеді. - ELISA әдісті пайдаланып қазіргі жұқпаны өтіп кеткен жұқпадан айырып анықтау мүмкін емес, - аурулардың қан құрамында Plasmodium қарсы түзілген барлық антиденелер анықталынады. - ДНҚ-диагностиканы.
Безгектің ДНҚ-диагностикасының негізіне P. falciparum ДНҚ-ның жоғары қайталанатын бөлігі алынды. Безгектің ДНҚ-диагностикасының барысы: - ДНҚ-зонд көмегімен паразит ДНҚ геномының библиотекасының скринингін іске асырады. - ДНҚ-зондпен будандастыруының ең жоғарғы дәрежесін көрсететін клондарын бөліп алады. - Клондарды безгекті қоздырмайтын Plasmodium түрлерінің ДНҚ-сымен будандастыруын зертейді.
Ерекше зонд ретінде алатын тізбегі: - P. falciparum ДНҚ-мен гибридизацияланады, - Р. vivax, P. cynomolgi ДНҚ-ларымен будандастырылмайды, адам ДНҚ-мен будандастырылмайды. - Зондтың көмегімен - тазартылған P. falciparum ДНҚ-ның 10 пг анықталынады, - қан құрамында ДНҚ-ның 1 нг анықталынады.
Анықтау әдістері ДНҚ-диагностикада радиоактивті изотоптармен, көбінесе 32 Р-мен таңбаланған зондтарды қолданады. Радиоактивті изотоптарды пайдалану қиыншылықтары: ерекше жабдықтар қажет, түзілген қалдықтарды қауіпсіз жою керек. Қазіргі күнде радиоактивті емес белгілермен таңбаланған зондтар алынды. Көбінесе биотинмен байланысқан нуклеотидтері бар ДНҚ-зондтарды пайдаланады.
Биотинмен байланысқан нуклеотидтері бар ДНҚ-зондтарды пайдаланатын әдістің барысы. 1. Биотинмен таңбаланған зондты нысана-ДНҚ-мен будандастырады. 2. Фильтрді жуып байланыспаған зондты кетіреді. 3. Авидинді (тауық жұмыртқасының ақуызы) немесе стрептавидинді (авидинге ұқсас бактерия ақуызы) қосады.
4. Биотинмен байланысқан ферментті қосады. Фермент ретінде сілті фосфатазаны немесе ақжелкек пероксидазаны пайдаланады. 5. Ферменттің түріне тәуелді хромогенді немесе хемилюминесцентті субстратты қосады. Ферменттің әсерінен субстрат түсі немесе люминесценциясы өзгеше өнімге айналады.
Генетикалық аурулардың молекулалық диагностикасы Генетикалық ауруларға геннің құрамындағы бір нүктелік немесе бірнеше өзгерістер себеп болуы мүмкін. Адамда тұқым қуалаушылық ауруды генетикалық деңгейде жүргізетін диагностиканы пайдаланып анықтайды. ДНҚ деңгейде іске асыратын тестер ерекше мутацияларды қатесіз анықтауға мүмкіндік береді. Гендің бұзылуының пренатальдық және аурудың симптомы әлі байқалмайтын кезеңдерінде аурудың диагностикасын іске асыруы мүмкін. Ауру бір геннің нүктелік өзгерісінің нәтижесінде даму мүмкін, орақ пішінді анемия. l Ауру әр түрлі сайттардағы мутациялардың нәтижесінде даму мүмкін, β-таласемия. l
Орақ пішінді анемия – генетикалық ауру. Гемоглобин молекуласының β-полипептидтік тізбегін кодтайтын генде бір нүктелік өзгерісі болады. Сау адамның гемоглобин (Нb. А) β-полипептидтік тізбегінің 6 -ші орында теріс зарядталған глутамин қышқылы, ауырған адамның гемоглобин молекуласының (Нb. S) β-полипептидтік тізбегінің 6 -ші орында бейтарап валин тұрады. Гемоглобин молекуласының кеңістік құрылымы өзгерген. Мутантты гемоглобин оттек молекуласының тасымалдаушысы ретінде тиімді қызметті атқара алмайды, ауруларда өте қатал анемия дамиды. Гетерозиготты аурулар (А/S) орақ пішінді анемияның сақтаушысы. Гетерозиготты аурулардың эритроциттерінің пішіні қалыпты, айналадағы ортада оттек концентрациясы төмендегенде, орақ пішінді анемия дамиды.
Орақ пішінді анемия ауруларда мутантты генді анықтау Гемоглобиннің -тiзбегiн кодтайтын геннің құрамында бір нуклеотид өзгергенде, Сvn 1 эндонуклеазаның әсеріне түсетін бір сайт жойылады. Сvn 1 эндонуклеаза ДНҚ құрамында СТNАGG тізбекті таниды да С пен Т арасындағы байланысты ыдыратады (N – төрт нуклеотидтердің кез келген біреуі). ДНҚ-ның СТNАGG сайтын Сvn 1 сайт деп атайды. Қалыпты генде бұл тізбек - ССТGАGG. Орақ пішінді анемияға себеп болатын генде - ССТGТGG. Мутантты генде аденіннің орнында тимин орналасады. Осы айырмашылығына орақ пішінді анемияның ДНҚ-диагностикасы негізделеді.
Орақ пішінді анемия ауруының сақтаушысын ДНҚ-диагностика пайдаланып анықтау әдісі: - ДНҚ-ның Сvn 1 сайттарды фланкирующие праймерлерді қолданып ДНҚ-ның шамалы мөлшерін ПЦР көмегімен амплификацияға ұшыратады. - Амплификацияға түскен сайттарды Сvn 1 эндонуклеазаның қатысуымен ыдыратады. - Түзілген рестрикция өнімдерін гель-электрофорез әдіспен бөледі де этидий бромидімен бояйды.
Орақ пішінді анемияның дамуына жауапты мутанты генді анықтау А. Сvn 1 эндонуклеазаның қатысуымен ПЦР-өнімнің рестрикциясы. - Қалыпты геннің праймерімен фланкирующий ДНҚ сегментінде үш Сvn 1 сайттары бар. - Мутантты генде – екі Сvn 1 сайттары бар. Б. Амплификация өнімдері. В. β-глобин ген Сvn 1 эндонуклеазаның әсері түскеннен кейін түзілген өнімдердің электрофореграммалары, АА – қалыпты β-глобин гендің гомозиготы, АS - гетерозиготты, SS - мутантты гендің гомозиготы.
β-Талассемия дамуына жауапты мутанты генді анықтау. β-Талассемия – гемоглобин молекуласының β-глобин белсенділігінің жоғалуына байланысты тұқым қуалаушылық ауру. Аурудың себебі β-глобинді кодтайтын геннің 8 сайтының кезгелген біреуінде нүктелік мутация жүзеге асады. Мутацияға ұшыраған гені бар - гетерозиготты адамдарда анемия төмен деңгейде дамиды, - гомозиготты адамдарда жоғары деңгейде дамиды Ауру адамдарға қан құю және басқа емдеулерді үнемі жүргізеді.
β-Талассемия дамуына жауапты мутанты генді анықтау. Бір геннің әр түрлі сайттарындағы мутацияларын табу үшін ПЦР/гибридизация әдісін жүзеге асырады. Әдістің барысы: - нуклеотидтен құрылған 20 зондтарды синтездейді. Әр зонд мутациясы бар нысана-геннің бір фрагментіне комплементарлы. - Әр зондтың 3'-соңына ұзындығы 400 нуклеотид шамасындай роly(d. T) гомополимерді қосады. - Гомополимердің көмегімен ДНҚ-зонд найлон-фильтрдегі белгілі бір нүктемен байланысады, - қалған ДНҚ-зондтың бөлігі бос түрінде қалады да гидридизациялану қабілеттілігі болады.
- Нысана-ДНҚ-ның сегменттерінің ПЦР көмегімен амплифициясын бір уақытта жүргізеді. Әр сегментте бір нүктелік мутация бар сайт болуы мүмкін. Праймердің біреуінде 5'-соңына биотин байланысқан. -ДНҚ-нысананың амплифицияланған фрагменттерін фильтрге байланысқан зондтармен гибридизациялайды. Қолданатын жағдайда толық комплементарлы тізбегі ғана гибридизацияланады.
- Қоспаға сілті фосфатазамен (ақжелкек пероксидаза, уреазамен) байланысқан стрептавидинді қосады. - Фильтрді жуады да боялмаған субстратты қосады. - ДНҚ-нысананың амплифицияланған сегменті мен ерекше олигонуклеотидтік зонд толық комплементарлы болғанда, фильтрде боялған нүкте пайда болады. - Бір фильтрге әр түрлі ерекше олигонуклеотидтердің зондтарына сәйкес нүктелерді енгізуге болады. Алынған нәтижені талдау арқылы мутация сайттын анықтайды.
Иммунодиагностика – иммунологиялық жүйенің қасиеттеріне негізделген әдіс. Иммунодиагностиканы кең қолданады: - ауруларды бағалау мен олардың мониторингін жүргізгенде, - дәрілік препараттарды зерттегенде, - биологиялық сұйықтарда ерекше метаболиттерді анықтағанда, - патогенді микроорганизмдерді теңестіру мен бақылауын жүзеге асырғанда.
Иммунноферменттік әдіс (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) Иммуноферменттік әдіс антиденелердің белгілі бір антигенге ұқсастығына негізделінеді, Иммунноферменттік әдісте біріктірілген иммунохимиялық анализдің ерекшелігі, ферменттің жоғары сезімталдығы. ELІSA әдісті пайдаланады: l аурулардың диагностикасын жүргізгенде, l сұйықтарда әр түрлі заттарды анықтағанда.
Иммуноферменттік анализ екі компонентінен құралады: *иммундық реакция, *ферменттік реакция. Иммундық реакция биологиялық молекулаларын, клетка элементтерін немесе микроорганизмдердің байланысуын қамтамасыздандырады, анықтайтын затты, микроорганизмді табады. Ферменттік реакция иммунологиялық реакция нәтижесін көру мен өлшеуіне мүмкіндік береді, ИФА барлық варианттары 3 негізгі қезеңдерінен құралады: 1. Анықтайтын затты оған бағытталғын ерекше антиденелерімен тану, нәтижесінде иммундық комплекс түзіледі. 2. Конъюгаттың иммундық комплексімен немесе бос орталықтарымен байланысуы 3. Ферменттік таңбаның тіркеуші сигналға айналуы
ИФА әдістердің вариантары Бәсеке және бәсеке емес ИФА әдістері - бірінші сатысында пайдаланатын реагенттерінің туріне байланысты. Бәсеке ИФА – бірінші кезеңінде жүйеде бір уақытта зерттейтін зат және ферментпен таңбаланған заттың таңбаланбаған аналогы болады. Заттын аналоғы анықтайтын зат ерекше байланысатын орталығына бәсеке. Бәсеке емес ИФА - бірінші кезеңінде жүйеде зертейтін зат ғана болады және оған ерекше байланысатын орталықтары.
Гомогенді және гетерогенді ИФА әдістері Гомогенді ИФА әдіс - барлық 3 кезеңі ерітіндіде өтеді, негізгі кезеңдерінің арасында иммунды комплексті әрекеттеспеген компонентерінен бөліп алу үшін қосымша этаптары болмайды. Гетерогенді ИФА әдіс, қатты фазалық әдіс - анализді екі фазалық жүйеде (қатты, ұстауш, және сұйық фазаларда) жүргізеді, - иммунды комплексті әрекеттеспеген компонентерінен бөледі (жұып жояды), Гомогенді-гетерогенді ИФА әдіс - бірінші кезеңі, ерекше комплекстің түзілуі ерітіндіде өтеді, - компонентерін бөлу үшін қатты фазаны иммобилденген реагентерді пайдаланады.
ИФА әдісте қен пайдаланатын ферменттер мен субстраттары Фермент реагент Источник получения Субстрат (рекомендуемая длина волны при фотометрии, нм) Конъюгирующий реагент Пероксидаза хрена Хрен (Armoracia rusticana) О-фенилендиаминдигидрохлорид (ОФД, 492 нм) 5 -аминосалициловая кислота (450 нм), диаминобензидин, о-дианизидин. Глутаральдегид Мета-периодат натрия N-сукцинимидил-3 (2 -пиридилдитио) пропионат β-D-галактозидаза E. Coli. E. О-нитрофенил-β-Dгалактозид (420 нм) Метамалеимидобензол-Nгидроксисукцинимидный эфир Щелочная фосфотаза Coli, слизистая Р-нитрофенилфосфат (405 кишечника теленка нм), 5 -Бром-4 -хлоро-3 индолил фосфат Глутаральдегид
Иммуноферментік анализдің түрлері: * Тікелей емес әдіс * Тікелей әдіс * Сэндвич әдіс
Тікелей әдіс: Антигенді қатты ұстаушқа енгізеді, антиденемен ферментті байланыстырады. Артықшылығы: *әдістің кезеңдері шамалы, *әдісті автоматандыру мүмкін. Кемшілігі: *күрделі әдіс, *ферментті коньюгаттарын синтездеу әдістің әмбебаптықсыздығы *ферменттің активтігіне ұлгінің компонентері әсер ету мүмкін.
Тікелей емес әдіс: *антигенді қатты ұстаушқа байланыстырады, *антигенге қарсы түзілген антиденелерді (бірінші антиденелер) қосады, *иммуноглобулиндерге қарсы алынған антиденелерді ферментпен байланыстырады. Иммуноглобулиндер антигенге қарсы бағытталған. Тәсілдің артықшылығы: *ферменттің каталитикалық қасиеттеріне әсер ететін эффектерін жою мүмкіндігі бар
Тікелей емес ИФА А. Зерттейтін үлгіні қатты төсенішпен байланыстырады. Б. Қатты төсенішпен байланысқан затқа қарсы алынған ерекше антиденені (Ант1) қосады, плашкаларды жуып байланыспаған Ант1 кетіреді. В. Екінші антиденені (Ант2) қосады, Ант2 бірінші антиденемен байланысады, ал нысана-молекуламен әрекеттеспейді. Ант2 молекуласымен ферментті байланыстырады (сілті фосфатаза, пероксидаза). Фермент боялмаған субстраттың боялған өнімге айналуын катализдейді. *Лункаларды жуып Ант1 мен байланыспаған Ант2 -фермент коньюгатын кетіреді. Г. Боялмаған субстратты қосады. Д. Боялған өнімнің сапалық немесе сандық мөлшерін анықтайды.
Сэндвич әдіс 1 - планшеттің үстіне антиденелерді жинайды, зертейтін антигендерге ерекше антиденелерді (антитела подложки). Байланыспаған антиденелерді жұып тастайды. 2 - Ұстаушқа зертейтін ұлгіні қосады. Антиген-антидене комплекс түзіледі. 3 - Ортаға жаңа (екінші) антиденелерді қосады. Екінші антиденелер антигендің екінші эпитопына қарсы түзілген, екінші эпитопты таниды да онымен байланысады. . Екінші антиденелер таңбамен байланысқан .
ELІSA әдісінің негізгі принципі: - бірінші антидененің антигенмен байланысуы. Антиген ретінде үлгімен байланысқан нысана-молекула болады. Бірінші антидене нысана үлгімен байланыспағанда, лункаларды бірінші рет жуғанда антиденелер толық кетіріледі. Екінші антидене-фермент коньюгат қосқанда Ант2 байланыспайды да екінші рет жуғанда кетіріледі. Субстратты қосқанда үлгі боялмаған түрінде қалады.
ELІSA әдісінің көмегімен анықтайды: l l әр түрлі ақуыздарды, вирустарды, бактерияларды, молекулалық салмағы төмен қосылыстарды. Бірінші антидене ретінде моноклоналды антиденелерді пайдаланғанда иммуноферменттік әдістің ерекшелігі және тиімділігі жоғарылайды. Моноклоналды антиденелердің негізінде стандартты диагностикалық реагенттер жасалады.
ИФА артықшылығы * жұқпаның ерте диагностикасын жүргізуге мүмкін, * жұқпа процестің даму динамикасын бақылау мүмкін, * анализдің жылдамдығы жоғары. ИФА кемшілігі * диагностика тікелей емес әдіспен жүзеге асырылады, * жұқпалы аурудың көздыргышына қарсы дамыған ағзаның иммундық жауабын анықтауға мүмкіндік береді, көздыргышты анықтамайды. Ферменттің каталитикалық қасиеттеріне әртүрлі эффектелірінің әсері болу мүмкін.
Адам қан сары суында инсулинді анықтау Диабет ауруының диагностикасы мен емдеу тиімділігін бақылауын инсулиннің сандық мөлшерін анықтап жүзеге асырады. Инсулин концентрациясын иммуноферменттік әдіспен анықтағанда керек: инсулинге қарсы антиденелер, инсулиннің белгілі концентрациясы бар стандартты ерітінділер, инсулин-пероксидаза коньюгаты (Инс-ПХ), пероксидазаның субстраттары (о-фенилендиамин немесе люминол), буферлерді дайындау реагенттері. Инсулин-пероксидаза коньюгатты перйодат әдіспен алады.
Инсулин мөлшерін анықтау әдісінің барысы 1. Полистирол планшеткаларының лункаларына иммуноглобулин ерітіндісін фосфат буферде енгізеді, инкубацияны жүргізеді (3 сағат 37 о), антиденелердің концентрациясы 5 мкг/мл. 2. Лункаларды фосфат буфермен жуады. Антиденелермен байланысқан планшеткаларды 6 ай 4 о-та сақтау мүмкін. 3. Лункалардың бірінші қатарына стандартты ерітінділердің 0, 2 мл енгізеді, басқа лункаларға зерттейтін ТФБ буфермен 2 есе сұйытылған сұйықтықты енгізеді. Стандарт ретінде инсулиннің әр түрлі концентрациясы бар ерітінділерді пайдаланады.
4. Инкубацияны іске асырады (12 -16 сағат, 4 о. С), лункаларды ТФБ буфермен жуады. 5. Әр лункаға Инс-ПХ коньюгаты мен ТФБ енгізеді, инкубацияны жүргізеді (15 минут 37 о. С немесе 1 сағат 4 о. С), лункаларды ТФБ-мен жуады да лункаларға субстратты қосады. 6. Түзілген өнімнің концентрациясын спектрофотометрлік немесе хемилюминесцентті әдіспен анықтайды. Инсулиннің стандартты концентрациясы бар лункаларды зерттеп алынған нәтижелерінің негізінде калибровты график құрады. Калибровты графикті пайдаланып зерттейтін сұйықтықта инсулин концентрациясын анықтайды.
Егуден кейін антиденелерді анықтау Егуден кейін антиденелердің деңгейін анықтау нәтижелері: - вакциналардың сапасын бақылау мен егу тиімділігіне баға қою үшін мүмкіндік туғызады, - ауру диагностикасының критериі ретінде болады
Егуден кейін тұмау вирусына қарсы антиденелерді анықтау Тұмау вирусына қарсы антиденелердің иммуноферменттік анализін жүзеге асырғанда қажет: - тұмау А вирусының тазартқан препараты, - адам иммуноглобулиндеріне қарсы антиденелердің пероксидазасымен коньюгаты, - - пероксидаза белсенділігін анықтау үшін 5 -аминосалицил қышқылы негізінде субстрат қоспасын дайындағанда пайдаланатын компоненттер, полистриролды планшеткалар, - спектрофотометр. -
Тұмау вирусына қарсы антиденелерді анықтау сатылары 1. Адам иммуноглобулиніне (Іg. G) қарсы ерекше антиденелерді аффиндік хроматография әдісінің көмегімен бөліп алады. Хроматографияны иммуносорбентпен толтырған бағаналарда жүзеге асырады. Иммуносорбент ретінде Іg. Gмен иммобилденген бромциан сефарозаны пайдаланады. 2. Ерітінділерде антиденелердің концентрациясын спектрофотометрлік әдіспен анықтайды. 3. Антидене-пероксидаза коньюгатын перйодат әдісін пайдаланып алады. 4. Тұмау вирусын адсорбция әдісімен тазалайды. Вирустарды флакондарға құяды (0, 5 мл), 50 -10 о. С сақтайды.
Егу жүргізгеннен кейін адамдарда антиденелердің деңгейін анықтау Адамнан тұмау вирусына қарсы вакцинацияның алдынан және егу жүргізгеннен кейін адамдарда антиденелердің деңгейін анықтайды, - Полистролды планшетканың лункасына тұмау вирусын енгізеді (5 мкг/мл, 0, 2 мл), планшеткаларды 4 о. С 18 -24 сағат ұстайды. Лункалардағы ерітіндіні төгеді де лункаларды ТФБ жуады, байланыспаған вирустарды кетіреді. Кептірген планшеткалар 4 о. С 2 ай, ал -50 -10 о. С 6 ай сақталуы мүмкін. - Бірінші лункаларға ТФБ-ның 100 мкл енгізеді (сары суы жоқ контроль). Басқа лункаларға сары сулардың 100 мкл енгізеді.
- Планшеткаларды 2 сағат үй температурасында ұстайды. - Лункалардан ерітіндісін төгіп тастайды, лункаларды жуады, ТФБ-мен және фильтр қағазды пайдаланып кептіреді. - Лункаларға антидене-пероксидаза коньюгаттың 100 мкл ерітіндісін енгізеді, 2 сағат өткеннен кейін ТФБ жуады. - Лункаларға субстрат ерітіндісін енгізеді. Планшеткаларды 40 минут үй температурасында ұстайды, - ферменттік реакция өніміің мөлшерін спектофотометрлік әдіспен өлшейді. - Тәжірибе және бақылау лункалардан алынған нәтижелерін салыстырады да антидененің концентрациясын анықтайды.
Энзимодиагностика – адамның биологиялық сұйықтығындағы ферменттердің белсенділік дәрежесі мен изоферменттің негізінде аурудың түрін анықтау. Ұлпалардың, жасуша жарғақшалары мен субжасушалық құрылымдарыдың зақымдануы ферменттердің белсенділігі мен мөлшерінің немесе изоферменттердің арақатынасының өзгеруіне әкеледі. Ферменттің белсенділігінің деңгейі мен изоферменттің түрін зерттеу нәтижесі аурудың түрін, зақымданған ұлпаның түрін, ұлпаның зақымдау дәрежесін анықтауға мүмкіндік береді.
Қан сары суында және басқа биологиялық сұйықтарда *ферменттердің белсенділік деңгейі, *изофермент түрінің негізінде зақымданған ұлпаны, аурудың түрін анықтауға болады. Ауру дамығанда қан сары суында 30 -дан астам ферменттердің белсенділігі өзгереді, жоғарылайды немесе төмендейді.
Энзимодиагностиканың негізгі принциптері - Ауру пайда болғанда кейбір жасушалар зақымданады да, қанның құрамында немесе басқа биологиялық сұйықтарда жасушаның ішінде орналасатын ферменттің мөлшері жоғарылайды. Сұйықтыққа шыққан ферменттің мөлшері ферментті анықтау үшін жеткілікті. - Жасуша зақымданғанда биологиялық сұйықтарға шыққан ферменттің белсенділігі ұзақ уақыт бойы турақты, қалыпты жағдайдағы белсенділігінен өзгеше. - - Ферменттер, көбінесе белгілі бір мүшенің ұлпасында орналасады, яғни ферменттерге мүше ерекшелігі тәң.
Жүректің ауруы дамығанда келесі фермқұрамындаенттердің белсенділігі және изоферменттердің мөлшері қан құрамында өзгереді: l l l аспартатаминотрансфераза, лактатдегидрогеназа, креатинкиназа.
Лактатдегидрогеназа (ЛДГ; L-лактат-НАД-оксидоредуктаза, КФ 1. 1. 1. 27) l тетрамер, екі түрлі (М және Н) суббөліктен құралады, l құрамында мырыш бар фермент, l адамның барлық жасушаларында түзіледі. Қызметі - барлық тірі ағзаларда көмірсулар анаэробты алмасуының негізгі ферменті: l сүт қышқылының пирожүзім қышқылына дейін тотығуын қайтымды катализдейді,
Жасуша цитоплазмасы мен қан сары суында лактатдегидрогеназаның 5 изоферменті кездеседі: ЛДГ 1, ЛДГ 2, ЛДГ 3, ЛДГ 4, ЛДГ 5. ЛДГ 1 мен ЛДГ 2 мөлшері өседі: l жүрек бұлшық еті зақымданған. ЛДГ 3 мен ЛДГ 4 -тің деңгейі жоғарылайды, ЛДГ 1 мен ЛДГ 2 деңгейі өзгермейді: l қаңқа бұлшық еті зақымданған, l бауырда қабыну процесі дамыған (гепатит), l бауыр ұлпалары вирус әсерінен және ССl 4, басқа улы заттардың әсерінен ағза улану нәтижесінде зақымданған.
Скачать презентацию МОЛЕКУЛАЛЫҚ ДИАГНОСТИКА Негізгі сұрақтары 1 Молекулалық диагностиканың жалпы
cbab35a3aaba67829623aec27f68c93d.ppt