Мобільні генетичні елементи бактерій
IS-елементи бактерій q Відносно короткі послідовності (зазвичай < 2000 п. н. ), q Містять на кінцях короткі (8 – 40 п. н) інвертовані повтори нуклеотидних (IR – inverted terminal DNA repeats) послідовностей (не завжди ідентичні) q 2 -3 гена, що контролюють їх транспозицію q Не містять генів, які б легко селекціонувалися q Виявляються за здатністю викликати мутації генів, в які відбувається інсерція IS-елементів q Викликають дуплікації ДНК-мішені q Різняться за специфічністю інсерцій q Відомо понад 1500 різних IS-елементів у більш, ніж 300 видах Bacteria і Archea q Їх розділено на понад 20 родин за подібністю організації, структури IR, будови транспозаз, які вони кодують, зокрема, їхніх каталітичних сайтів
q Відкриті в середині 60 -х років ХХ століття під час вивчення причин спонтанних мутацій в бактерій на моделі gal-оперону E. coli q Відкрито новий клас мутацій: § як нонсенс- мутації вони виявляють сильний полярний ефект на експресію генів оперону, дистальних по відношенню до мутації § це це не нонсенс-мутації, бо не супресуються нонсенс-супресорами § ревертують до дикого типу як точкові мутації, але на відміну від точкових мутацій, мутагени не збільшують частоти реверсій PO gak. E gal. T gal. K IS Галактокіназа Для відбору мутантів за дистальним геном gal. K використали середовище з 2 -дезоксигалактозою Галактокіназа фосфорилює 2 -дизоксигалактозу у токсичний продукт
Типи повторів нуклеотидних послідовностей ДНК 1. Прямі повтори: 5’-AAGAGNNNNNNAAGAG 3’ 3’-TTCTCNNNNNNTTCTC 5’ 2. Прямі тандемні повтори: 5’-NNNAAGAGAAGAGNNNNNN 3’ 3’-NNNTTCTCTTCTCNNNNNN 5’ 3. Інвертовані повтори: 5’-NGTCCAGN. . . NNCTGGACN-3’ 3’-NCAGGTCN. . . NNGACCTGN-5’ 5’ N N N GC AT CG CG TA GC 3’ Структура “Стебло-петля”
IS-елементи E. coli ISелемент Розмір, п. н. Інвертовані термінальні повтори Прямі Сайти інсерцій повтори ДНК-мішені IS 1 768 23 9 випадкові IS 2 1327 41 5 гарячі точки IS 4 1428 18 11 або 12 AAAN 20 TTT IS 10 R 1329 22 9 NGCTNAGCN IS 50 R 1533 19 8 гарячі точки q Відкриті в середині 60 -х років ХХ століття під час вивчення причин спонтанних мутацій в бактерій q Відносно короткі послідовності (зазвичай < 2000 п. н. ), містять на кінцях короткі інвертовані повтори нуклеотидних послідовностей та 2 -3 гена, що контролюють їх транспозицію q Виявляються за здатністю викликати мутації генів, в які вони включається q Викликають дуплікації ДНК-мішені. Різняться за специфічністю інсерцій
Полярний ефект інсерцій МГЕ на дистальні гени оперона PO gak. E × gal. T gal. K IS ×-термінація транскрипції Мутації gal-генів зумовлені інсерційними послідовностями ДНК (insertion sequences) густина λgal+ в середині 60 -х років ХХ століття під час вивчення причин спонтанних мутацій в λgal+ λgal- Ультрацентрифугування в градієнті густини Cs. Cl λgal-: : IS Частинки λgal- мають вищу плавучу густину порівняно з λgal+ оскільки містять більшу молекулу ДНК з інсерцією IS-елемента
Дуплікації ДНК-мішені після інсерції МГЕ ATGCA TACGT ДНКмішень Інсерція МГЕ ATGCA МГЕ TACGT Репарація ДНК-мішені ATGCA TACGT МГЕ ATGCA TACGT Дуплікації ДНК-мішені
IS 1 - елемент _ Ins. A IRL, IRR – лівий та правий термінальні повтори Ins. AB’ + P IRL 1 ins. A Ins. A ins. B’ 91 1 IRR p. IRL-промотор з якого починається транскрипція генів ins. A та ins. B’ (позначена стрілкою) Гени ins. A та ins. B’ частково перекриваються Ins. AB’ 232 q Білок Ins. A (91 амінокислотний залишок) зв’язується з IRR та IRR, інгібує транскрипцію з p. IRL та транспозицію, конкуруючи з транспозазою за IRR та IRR q Білок Ins. AB’ (232 амінокислотних залишки)є транспозазою і також вазємодіє з IRR та IRR
Модульні Tn-елементи E. coli (транспозони) Tn. Розмір, п. н. елемент Ген стійкості Термінальні модулі Оріентація модулів Функціональність модулів Tn 5 5818 kan. R str. R bleo. R IS 50 L інвертовані + - (заміна 1 нк) Tn 9 2638 cam. R IS 1 прямі + Тn 10 ~9300 tet. R IS 10 S інвертовані + - (відмінні за 2, 5% нк) q Містять на кінцях прямі або інвертовані повторення IS-елементів та один або декілька генів, що зазвичай визначають стійкість до антибактерійних агентів q Здатність модульних Tn-елементів до транспозиції визначається ISелементами. IS–елемент може переміщатися незалежно від транспозона, в який він входить q Функціональними можуть бути обидва IS–елементи, або лише один з них
Транспозон Tn 5 1533 2752 IS 50 L 19 p 3 p 4 kan. R 19 1533 str. R bleo. R IS 50 R 19 19 p 1 (Tnp) p 2 (Inh) q Містить гени стійкості до канаміцину (kan. R) стрептоміцину (str. R ) та блеоміцину (bleo. R), оточені інвертованими послідовностями IS 50 -елементів q IS 50 R кодує транспозазу (Tnp) та інгібітор транспозиції (Inh) q IS 50 L містить нонсенс-мутацію та та кодує нефункціональні аналоги Tnp та Inh q Білки Tnp та Inh транслюються в одній рамці зчитування. Ініціаторний кодон (AUG) Inh розташований на віддалі 55 кодонів від ініціаторного кодону (AUG) Tnp q Білок Tnp діє як транспозаза in cis. In trans він діє як інгібітор транспозиції інших Tn 5 та IS 50, присутніх у клітині
Транспозон Tn 3 3066 IR tnp. A 38 res 558 861 tnp. R amp. R IR 38 q Містить на кінцях короткі інвертовані повтори та 3 гени: § amp. R – β-лактамази ( визначає стійкість до ампіциліну) § tnp. A – транспозази § tnp. R – інгібітора транскрипції гена tnp. A та власного гена q Білок Tnp. R функціонує також і як резольваза, що каталізує роз’єднання (англ. resolve) коінтегратів, що є проміжними продуктами транспозиції (res – сайт, в якому діє резольваза)
Кон’югативні транспозони (c. Tn) q Відкриті в кінці 70 -х років ХХ столітття під час вивчення механізму трансмісивної резистентності бактерій до антибіотиків, що не пов’зана з плазмідами q Широко розповсюджені серед бактерій – збудників інфекцій q Розміри: с. Tn грам-позитивних бактерій – 18 -60 т. п. н. с. Tn грам-негативних бактерій - 65 -150 т. п. н. q Не мають кінцевих повторів нуклеотидних послідовностей на кінцях, не викликають дуплікацій ДНК-мішені під час транспозиціїї q Як транспозони - вбудовуються у різні реплікони клітини і можуть переміщатися в інші місця реплікону, несуть гени стійкості до антибіотиків q Як плазміди – мають власні tra-системи, зумовлюють кон’югацію, власне перенесення та мобілізацію корезидентних репліконів q Як помірні бактеріофаги – вбудовуються у ДНК мішень і вирізаються з неї. Ці процеси каталізують білки, що кодуються c. Tn – інтеграза Int та білок вирізання (ексцизії) Xis c. Tn 916 з Enterococcus faecalis - 18 т. п. н. - 24 ORF int xis tet. R tra
Перенесення кон’югативних транспозонів 3 Int Плазміда Int 1 Xis Хромосома 5 с. Tn Tra с. Tn 2 Int 4 c. Tn 6 Int Хромосома 1. Вирізання c. Tn з хромосоми, зумовлене продуктами генів xis (білком вирізання) та int (інтегразою), а також його циклізація 2. Інтеграція c. Tn у вихідний сайт хромосоми за участю інтегрази Int 3. Транспозиція c. Tn у плазміду за участю інтегрази Int 4. Транспозиція c. Tn в інший сайт хромосоми за участю інтегрази Int 5. Кон’югаційне перенесення c. Tn в іншу клітину, що контролюється генами tra c. Tn (розщеплення однієї нитки ДНК в ori. T та її перенесення через кон’югаційний місток, кон’югаційний синтез ДНК c. Tn у донорі та реципієнті) 6. Інтеграція c. Tn в хромосому реципієнта
Мобілізація корезидентних плазмід, зумовлена c. Tn Tet. R Мобілізація корезидентної плазміди in trans Tra Мобілізація плазміди in cis: 1. Транспозиція c. Tn у плазміду Tra 2. Кон’югаційне перенесення плазміди з c. Tn
Генні касети та інтегрони Генна касета: Рекомбінаційний сайт -“ 59 п. н. елемент” Ген резистентності Автономна кільцева форма генної касети Інтегрони: int. I att. I Рant aad q Генні касети – найменші з МГЕ бактерій – від ~260 до ~1500 п. н. sul Pint int. I att. I Рant aac aad sul Pint int. I – ген інтегрази інтегрона att. I – послідовність, яка бере участь у сайтспецифічній рекомбінації між інтегроном та генною касетою aac – ген аміноглікозидацетилтрансферази aad – ген аміноглікозидаденілтрансферази sul – ген стійкості до сульфамідів Pint – промотор гена інтегрази q Існують: 1) як частини інтегронів у хромосомі (часто поруч з іншими генними касетами); 2) як кільцеві молекули – поза хромосомою q Генні касети можуть бути інтегрованими у неспецифічні сайти хромосоми q Генні касети транскрибуються з промоторів інтегронів (Рant)
Переміщення генних касет 1. Інтерація генної касети в інтегрон (зворотний процес) 2. Інтергація генної касети в неспецифічний сайт (незворотний процес) : а) без промотора; б) з промотором 59 п. н. int. I × 59 п. н. sul × att. I а. Int. I int. I att. I Pant Int. I sul “Мовчазний” ген Ген у складі інтегрона б. P Ген, що функціонує
Типи транспозиції мобільних генетичних елементів бактерій Молекуладонор МГЕ 1. Молекула – реципієнт МГЕ 3. 2. CTn, генні касети Tn 5, Tn 10 1. Нереплікативна Коінтеграт 2. Реплікативна 3. Консервативна 4. Tn 3
Реплікативна транспозиція. Етапи 1 та 2 1. Розриви ланцюгів ДНК (позначені стрілками) 2. З’єднання ланцюгів a і d та bіc Синтез ДНК (стрілки показують напрям синтезу) Плазміда - донор, що містить транспозон (чорні прямокутники) Плазміда -реципієнт (червоними прямокутниками позначені послідовності ДНК-мішені)
Реплікативна транспозиція. Етапи 3 та 4 3. Коінтеграт × Кросинговер між копіями транспозону 4. Роз’єднання коїнтеграту Плазміда - донор, що містить гібридний транспозон Плазміда –реципієнт з транспозоном та дуплікацією ДНК-мішені
Нереплікативна транспозиція (cut and past) Фрагмент молекули – донора МГЕ (чорний прямокутник) Розриви ланцюгів ДНК Утворення “шпильок” на кінцях Tn Фрагмент молекули – реципієнта МГЕ 3’OH Розриви ланцюгів ДНК 3’OH Розщеплення “шпильок” Перенесення та з’єднання ланцюгів Синтез ДНК Молекула-донор з прогалиною на місці МГЕ Молекула –реципієнт МГЕ з дуплікацією ДНК-мішені
МГЕ – важливі чинники мінливості бактерій q МГЕ зумовлюють мутації генів, в які вони включаються q МГЕ виявляють полярні ефекти на дистальні гени оперонів q МГЕ можуть виконувати роль “мандрівних” промоторів/термінаторів транскрипції генів – “перемикачів” роботи генів Чергування Gal+/Gal- - фенотипів, зумовлене інсерцією МГЕ та наступною його інверсією Gal+ (індукується) Pgal Інсерція МГЕ Pgal P gal Інверсія МГЕ Pgal P gal Gal+ (конститутивний) Gal-
Перебудови нуклеотидних послідовностей, зумовлені МГЕ a b c d d a Кросинговер між копіями МГЕ a f Делеція ділянки генома cd, що оточена прямими повторами МГЕ c b e × b e e f f d + c
Скачать презентацию Мобільні генетичні елементи бактерій IS-елементи бактерій q
MG_10.ppt