МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ Г. СЕМЕЙ КАФЕДРА МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ И ГИСТОЛОГИИ Зав. кафедрой: д. б. н. , профессор Мынжанов М. Р. СРС Тема: Молекулярно-генетические методы исследования.
План: 1. Введение. 2. Сущность молекулярно-генетических методов. 3. Виды молекулярно-генетических методов а)Саузерн-блоттинг б)ПЦР в)Гибридизация г)Анализ полиморфизма длины рестрикционных элементов 4. Заключение 5. Список использованной литературы
Молекулярно-генетические методы большая и разнообразная группа методов, предназначенная для выявления вариаций (повреждений) в структуре участка ДНК (аллеля, гена, региона хромосомы) вплоть до расшифровки первичной последовательности оснований. В основе этих методов лежат генно инженерные манипуляции с ДНК и РНК. Исходным этапом всех молекулярно генетических методов является получение образцов ДНК.
Важнейший этап идентификации гена его выделение. ДНК может быть изолирована из любого типа тканей и клеток, содержащих ядра. Этапы выделения ДНК включают: быстрый лизис клеток, удаление с помощью центрифугирования фрагментов клеточных органелл и мембран, ферментативное разрушение белков и их экстрагирование из раствора с помощью фенола и хлороформа, концентрирование молекул ДНК путем преципитации в этаноле.
В генетических лабораториях ДНК чаще всего выделяют из лейкоцитов крови, для чего у пациента забирают 5 20 мл венозной крови в стерильную пробирку с раствором антикоагулянта (гепарин). Затем отделяют лейкоциты и проводят их обработку по изложенным выше этапам.
Следующий этап подготовки материала к исследованию «разрезание» ДНК на фрагменты в участках со строго специфической последовательностью оснований, которое осуществляют с помощью бактериальных ферментов рестрикционных эндонуклеаз (рестриктаз). Рестриктазы узнают специфические последовательности из 4 6, реже 8 12 нуклеотидов в двухцепочечной молекуле ДНК и разделяют её на фрагменты в местах локализации этих последовательностей, называемых сайтами рестрикции. Количество образующихся рестрикционных фрагментов ДНК определяется частотой встречаемости сайтов рестрикции, а размер фрагментов характером распределения этих сайтов по длине исходной молекулы ДНК.
Для получения ДНК зондов используют метод клонирования генов. Сущность метода состоит в том, что фрагмент ДНК, соответствующий какому либо гену или участку гена, встраивают в клонирующую частицу, как правило, бактериальную плазмиду (кольцевая внехромосомная ДНК, при сутствующая в клетках бактерий и несущая гены устойчивости к антибио тикам), и затем бактерии, имеющие плазмиду со встроенным человеческим геном, размножают. Благодаря процессам синтеза в плазмиде удаётся получить миллиарды копий человеческого гена или его участка. В дальнейшем полученные копии ДНК, меченные радиоактивной меткой или флюорохромами, используют в качестве зондов для поиска комплементарных последовательностей среди исследуемого пула молекул ДНК. В настоящее время существует множество разновидностей методов с использованием ДНК зондов для диагностики генных мутаций.
Саузерн-блоттинг Саузерн блоттинг (разработан Э. Саузерном и Р. Дэйвисом в 1975 г. ) основной метод, с помощью которого в настоящее время выявляют гены определённого заболевания. Для этого ДНК из клеток больного экстрагируют и обрабатывают одной из рестрикционных эндонуклеаз (или несколькими). Полученные фрагменты подвергают электрофорезу, который позволяет разделить их по размеру (фрагменты меньшего размера двигают ся через поры геля быстрее). Затем фрагменты переносят (перепечатывают) на нитроцеллюлозный фильтр, на который наслаивают меченный радио активной меткой зонд. Зонд связывается только с комплементарной последовательностью. Затем методом авторадиографии определяют положение искомого фрагмента геномной ДНК на электрофореграмме. Гибридизацию с меченым ДНК зондом препаратов ДНК или РНК, нанесённых капельно на твёрдый матрикс без предварительной рестрикции и электрофореза, носит название дот или слот гибридизации в зависимости от конфигурации пятна ДНК на фильтре (округлой или продолговатой соответственно).
Гибридизация in situ Процедуру гибридизации можно проводить не только на геле, на фильтрах или в растворе, но и на гистологических или хромосомных препаратах. Этот метод носит название гибридизации in situ. Вариант метода, при котором в качестве зондов используют препараты ДНК или РНК, мечен ные флюорохромами, FISH (fluorescein in situ hybradization). Меченный ДНК зонд наносят на препараты дифференциально окрашен ных и подготовленных для гибридизации (денатурированных) метафазных хромосом. Предварительная обработка хромосом применяется для облегчения доступа зонда к геномной ДНК. После отмывки несвязанных молекул ДНК и нанесения светочувствительной эмульсии (при использовании радиоактивной метки), либо проведения соответствующей обработки (при использовании биотин или флюоресцеин меченных ДНК зондов) места локализации последовательностей ДНК, комплементарных используемому ДНК зонду, можно непосредственно выявлять при микроскопии в виде ха рактерных точек над соответствующими участками определённых хромосом. Данный метод исследования позволяет определить не только хромосомную принадлежность, но и внутрихромосомную локализацию исследуемого гена.
Полимеразная цепная реакция ПЦР новое достижение молекулярной генетики, используется для aмплификации ДНК и позволяет быстро размножить in vitro специфический участок ДНК (то есть любой интересующий ген) более чем в 200 000 раз. Чтобы провести реакцию, достаточно иметь ДНК материал одной клетки; количество амплифицированной с помощью ПЦР ДНК столь велико, что эту ДНК можно просто окрашивать (использование радиоактивных зондов после электрофореза не требуется). Необходимое условие для проведения ПЦР знание нуклеотидной последовательности амплифицируемой области ДНК для правильного подбора искусственно синтезированных праймеров.
ПЦР протекает автоматически в программируемом термостате термоциклере (амплификаторе). Трёхступенчатый цикл, в результате которого получаются точные копии идентифицируемого участка матричной ДНК, повторяют 30 50 раз в соответствии с заданной программой термоциклера. В первом цикле олигопраймеры гибридизуются с исходной матричной ДНК, а затем (в последующих циклах) и с вновь синтезированными молекулами ДНК по мере их накопления в реакционной смеси. В последнем случае синтез ДНК заканчивается не вследствие изменения температурного режима, а по достижении ДНК полимеразной границы амплифицированного участка, что и определяет размер вновь синтезированного участка ДНК с точностью до одного нуклеотида.
В качестве метода детекции полученных молекул ДНК используют электрофорез, с помощью которого производится разделение амплифицированного материала по размеру ампликонов (продуктов амплификации). С помощью ПЦР можно непосредственно исследовать места локализации предполагаемых мутаций или полиморфных сайтов, а также изучать наличие любых других специфических особенностей ДНК.
Анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов Для выделения полиморфных участков ДНК применяются бактериальные ферменты рестриктазы, продуктом которых являются сайты рестрикции. Спонтанные мутации, возникающие в полиморфных сайтах, делают их резистентными или, наоборот, чувствительными к действию специфичной рестриктазы.
Мутационная изменчивость в сайтах рестрикции может быть обнаружена по изменению длины рестрикцированных фрагментов ДНК, путём разделения их с использованием электрофореза и последующей гибридизации со специфическими ДНК зондами. При отсутствии рестрикции в полиморфном сайте на электрофореграммах будет выявляться один крупный фрагмент, а при её наличии будет присутствовать меньший по размеру фрагмент. Наличие или отсутствие сайта рестрикции в тождественных локусах гомологичных хромосом позволяет достаточно надёжно маркировать мутантный и нормальный ген и проследить его передачу потомству. Таким образом, при исследовании ДНК пациентов, в обеих хромосомах которых присутствует сайт рестрикции в полиморфной области, на электрофореграмме будут выявляться короткие фрагменты ДНК. У пациентов, гомо зиготных по мутации, изменяющей полиморфный сайт рестрикции, будут выявляться фрагменты большей длины, а у гетерозиготных короткие и длинные фрагменты.
Заключение Молекулярно-генетический анализ это единственная на сегодняшний день возможность выявить генетическую предрасположенность к различным болезням задолго до их возникновения. Генетическое исследование – это прогнозирование заболеваний с целью их предупреждения, а не диагностика уже имеющихся болезней. Что дает генетическое исследование? Большинство распространенных заболеваний повышенное артериальное давление, инфаркт, бронхиальная астма, сахарный диабет, онкологические заболевания и многие другие «предопределены» в наших генах. С помощью генетического анализа можно достоверно узнать, носителем какого генотипа Вы являетесь, и составить Вашу персональную «Генетическую карту здоровья» . Молекулярно генетический анализ надежен и высоко информативен. Это исследование выполняется он всего один раз, так как результат исследования не меняется на протяжении всей жизни
Список используемой литературы: http: //spbgspk. ru/ http: //ru. wikipedia. org kcrm. ru ropab. ru/lab/molecular-genetics. html
Скачать презентацию МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ
Молекулярно-генетические методы исследования.ppt