Министерство здравоохранения Республики Беларусь учреждение образования Мозырский государственный медицинский колледж Индивидуальное задание по практике По дисциплине: Биохимия с биохимическими исследованиями По теме: Определение активности аланинаминотрансферазы в сыворотке крови кинетическим методом Подготовила учащаяся : МДд 22 Сопот Карина Юрьевна Специальность: Медико диагностическое дело Приняла: Дунайская Н. Е. Мозырь, 2017
Аминотрансферазы (трансаминазы) — ферменты, катализирующие межмолекулярный перенос аминогруппы от соответствующих аминокислот на a‑кетокислоты (2‑оксокислоты) с образованием новых кето и аминокислот без образования свободного аммиака, в качестве кофермента используется витамин В 6 (пиридоксин). Эти ферменты играют центральную роль в обмене белков, осуществляя окислительное дезаминирование аминокислот опосредованно через глутаминовую кислоту. Образующаяся глутаминовая кислота дезаминируется глутаматдегидрогеназой с освобождением свободного аммиака и 2‑оксоглутаровой кислоты.
В организме человека наибольшее значение имеют две аминотрансферазы: аспартатаминотрансфераза (АСТ или Ас. АТ) (L‑аспартат: 2‑оксоглутарат амино трансфераза, КФ 2. 6. 1. 1. ) и аланинаминотрансфераза (АЛТ или Ал. АТ), (L‑аланин: 2‑оксоглутарат аминотрансфераза, КФ 2. 6. 1. 2. ). В клинической практике чаще всего определяют именно активность этих двух ферментов. Существует также другое название указанных ферментов: для АСТ — глутамат оксалоацетат амино трансфераза (ГОАТ), для АЛТ — глутамат пируват амино трансфераза (ГПАТ). Ниже приведены реакции, катализируемые этими ферментами: 2 Оксоглутарат + Аспартат ↔ Глутамат + Оксалоацетат 2 Оксоглутарат + Аланин ↔ Глутамат + Пируват
В основе спектрофотометрических методов лежит использование оптического теста Варбурга (см выше). Эти методы являются наиболее специфичными и точными для исследования активности трансаминаз сыворотки крови, основаны на различии поглощения окисленной и восстановленной форм НАД при 340 нм и требуют постановки индикаторных реакций, в которые вовлекаются продукты основной реакции:
Существующие методы определения активности трансаминаз в сыворотке крови можно разделить на две основные группы: колориметрические и спектрофотометрические:
В основе спектрофотометрических методов лежит использование оптического теста Варбурга. Эти методы являются наиболее специфичными и точными для исследования активности трансаминаз сыворотки крови, основаны на различии поглощения окисленной и восстановленной форм НАД при 340 нм и требуют постановки индикаторных реакций, в которые вовлекаются продукты основной реакции: Оксалоацетат + НАДH ↔ Малат + НАД Пируват + НАДH ↔ Лактат + НАД
Группа колориметрических методов: основанные на образовании окрашенного динитрофенилгидразона пировиноградной кислоты. Наибольшее применение нашел метод Райтмана‑Френкеля, являющийся технически простым и дающим воспроизводимые результаты. азометоды, основанные на образовании цветного соединения между щавелевоуксусной кислотой и 6‑бензамидо 4‑метокситолуидин диазо ниевым хлоридом. Эти методы используются для определения активности АСТ, просты в исполнении, но требуют редких реактивов.
Влияющие факторы Аспирин, барбитураты, пенициллин, опиаты, прием пиридоксальфосфата, внутримышечные инъекции завышают результаты исследования. Необходимо избегать гемолиза, так как в эритроцитах активность фермента в 6 раз выше, чем в сыворотке.
Клинико‑диагностическое значение Определение активности АСТ и АЛТ является чувствительным тестом для диагностики инфаркта миокарда, который не выявляется на ЭКГ, активность АСТ возрастает через 4‑ 6 часов от начала ангинального приступа, спустя 24‑ 36 часов достигает максимума и нормализуется на 3‑ 7 день. Вторичное повышение свидетельствует о повторном инфаркте. Величина активации фермента зависит от обширности поражения миокарда: в тяжелых случаях установлено 20‑кратное повышение активности АСТ и 10‑кратная активация АЛТ.
Особенно важное значение имеет определение активности аминотрансфераз для диагностики заболеваний печени. Некроз или повреждение печеночных клеток любой этиологии (острый и обострения хронического гепатита, холестатическая и обтурационная желтуха, лекарственно индуцированное поражение) сопровождаются повышением активности обоих ферментов, преимущественно АЛТ, коэффициент де Ритиса = АСТ/АЛТ < 1, 33. Уже в продромальном периоде болезни Боткина и у больных с безжелтушной формой гепатита активность АЛТ достоверно возрастает. Выявлены случаи, когда активность АЛТ составила 64 ммоль/ч·л, а АСТ — 27 ммоль/ч·л.
Менее высокое увеличение активности отмечено при циррозе печени, травме скелетных мышц, миозите, миопатиях, тепловом ударе, миокардите, некоторых опухолях печени, гемолитических болезнях.
Ход определения Перед определением температура растворов и сыворотки должна быть доведена до температуры измерения. Перед работой можно готовить смесь реактивов, состоящую из субстратно буферного раствора, раствора НАДН, МДГ и ЛДГ в соотношении 60 : 1 : 1. Определение проводят по следующей схеме. Перемешивают и через 60 сек. (лаг фаза) измеряют экстинкцию и одновременно включают секундомер. Точно через 1, 2, 3 мин (или через более короткие, но равные промежутки времени) измеряют экстинкцию. Поправку на холостой опыт проводят по формуле: (ΔΕ/Δt)оп – (ΔΕ/Δt)хол = (ΔΕ/Δt)скор. Скорректированную величину опытной пробы используют в дальнейших расчетах.
Расчет производят по формуле: Активность, моль/(с∙м 3) = нмоль/(с∙л) ґ 106 = Vр. с / ε ґ 1∙Vсыв ґ (ΔΕ / Δt)скор, где Vр. с — объем реакционной смеси, мл; Vсыв — объем сыворотки, мл; t — время реакции, сек. ; ΔΕ / Δt — изменение экстинкции за 1 сек. ; ε — κоэффициент молярной экстинкции НАДН в м 2 ґ моль– 1; 1 — толщина слоя жидкости в кювете в метрах (1∙ 102).
Определение активности фермента можно проводить по микрометоду. Для этого перед работой готовят смесь реактивов, состоящую из субстратно буферного раствора, растворов НАДН, ЛДГ, МДГ в соотношении 60 : 1 : 1. Опытная проба включает смесь реактивов — 0, 630 мл, сыворотку — 0, 10 мл, α кетоглутаровую кислоту — 0, 02 мл. Холостую пробу ставят так же, как опытную, но вместо сыворотки добавляют 154 ммоль/л раствор хлорида натрия. Определение проводят по той же схеме, что и в макрометоде.
Спасибо за внимание!
Скачать презентацию Министерство здравоохранения Республики Беларусь учреждение образования Мозырский государственный
Сопот К.Ю.pptx