Микроскопия 3 лекция Микроскопия: •

Микроскопия 3 лекция

Микроскопия: • Оптическая • Электронная • Рентгеновская • Сканирующая зондовая

Оптическая микроскопия

Простые микроскопы появились в XVII в. Больших успехов в их изготовлении добился голландский ученый А. Левенгук. В 1609— 1610 гг. сложный микроскоп был построен Г. Галилеем (1564— 1642). В 1846 г. немецкий механик Карл Цейсе (1816— 1888) открыл мастерскую и через год приступил к изготовлению микроскопов. Карл Цейсе успешно использовал в деятельности своей фирмы открытия профессора физики Эрнста Аббе, который впоследствии становится его полноправным компаньоном. Теоретические и практические работы Эрнста Аббе (1840— 1905), Отто Шотта (1851 — 1935) и Августа Келера(1866— 1948)определили направление развития и принципы построения оптических систем современных микроскопов.

Оптическая схема микроскопа • 1–осветительная лампа; 2–линза, используемая для равномерного освещения объекта; 3–полевая диафрагма для ограничения светового пучка; 4–зеркало; 5– апертурная диафрагма для ограничения светового пучка; 6–конденсор; 7 рассматриваемый объект (препарат); • 7’–увеличенное действительное изображение объекта; 7’’–увеличенное мнимое изображение объекта; 8–объектив; 9 –окуляр; 10–предметный столик • Объект 7 (стрелочка) находится на предметном столике перед объективом 8 на расстоянии, несколько большем его фокусного расстояния F 0 б. Объектив образует действительное, увеличенное и перевёрнутое изображение T в плоскости полевой диафрагмы 10, лежащей за передним фокусом FOK окуляра 11. Это промежуточное изображение рассматривается через окуляр, который даёт дополнительное увеличение и образует мнимое изображение 7” на расстоянии наилучшего видения D =250 мм. При этом на сетчатке глаза образуется действительное изображение объекта

Основные характеристики микроскопа: видимое увеличение Г , линейное поле зрения 2 y числовая апертура NА. • Увеличение объектива выражается формулой: b=D/f'об, где D — расстояние между задним фокусом объектива f'об и передним фокусом окуляра fок (т. н. оптич. длина тубуса М. ); f'об— фокусное расстояние объектива. Увеличение окуляра, подобно увеличению лупы, выражается формулой: • Гок= 250/f'ок, где f'ок — фокусное расстояние окуляра. Обычно объективы имеют увеличения от 6, 3 до 100, а окуляры от 7 до 15. Поэтому общее увеличение Микроскопа - в пределах от 44 до 1500. Ирисовые полевая диафрагма 3 и апертурная 5 служат для ограничения светового пучка и уменьшения рассеянного света.

• Разрешающая способность - это величина, обратная такому наименьшему расстоянию, на котором два соседних элемента структуры ещё могут быть видимы раздельно. Разрешающая способность ограничена дифракцией света. Вследствие дифракции изображение бесконечно малой светящейся точки, даваемое объективом микроскопа, имеет вид круглого светлого диска (окружённого тёмными и светлыми кольцами), диаметр диска равен: d=l, 22 /А, где —длина волны света и А — числовая апертура объектива, равная: А = nsin /2 (n — показатель преломления среды, находящейся между предметом и объективом, — угол между крайними лучами конического светового пучка, выходящего из точки предмета и попадающего в объектив). Если две светящиеся точки расположены близко друг от друга, их дифракционные картины накладываются одна на другую, давая в плоскости изображения сложное распределение освещённости. Минимальная относительная разница освещённостей, которая может быть замечена глазом, равна 4%. Этому соответствует наименьшее расстояние, разрешаемое в микроскопе D=0, 42 d=0, 51 /А. Для несамосветящихся объектов предельное разрешение Dпр составляет = /(А+А'), где А'— числовая апертура конденсора микроскопа. Разрешающая способность =1/D прямо пропорциональна апертуре объектива и для её повышения пространство между предметом и объективом заполняется жидкостью с большим показателем преломления

Просвечивающий электронный микроскоп (слева) и растровый электронный микроскоп (справа)

• Пучок электронов можно использовать для создания изображения поверхности. В просвечивающем эл. Микроскопе электроны из источника (электронной пушки) попадают на образец, рассеиваются при прохождении через него, фокусируются объективной линзой (Obj Lens), проходят через проекторную линзу (Proj Lens) и создают изображение. Длина волны электронов =0, 0388/ U (нм), U –ускоряющее напряжение в к. В. Изображение формируется, т. к. разные атомы рассеивают и поглощают быстрые электроны с разной эффективностью. Если атомы находятся на расстоянии, большем нескольких постоянных решетки, их можно разрешить этой методикой.

Микрофотография медной контактной площадки, поврежденной коррозией

Электронная линза Витки проводов катушки, по которым проходит ток, фокусируют пучок электронов так же, как стеклянная линза фокусирует световой пучок

Микрофотография оксида железа

Просвечивающий электронный микроскоп ПЭМ является фактическим аналогом светового микроскопа. Исследуемый образец располагается в области объективной линзы 5. Проекционная и промежуточная линзы выполняют функцию окуляра. Изображение формируется на флуоресцирующем экране. 1 - катод, 2 - управляющий электрод, 3 - анод, 4 - конденсорная линза, 5 - объектная линза, 6 - апертурная диафрагма, 7 - селекторная диафрагма, 8 - промежуточная линза, 9 - проекционная линза, 10 – экран

В ПЭМ объект исследования должен пропускать пучок электронов. Первостепенная задача исследователя - обеспечение двух условий: малой толщины образца и избирательного взаимодействия электронов с разными деталями образца. Микроскоп снабжается камерой, в объёме которой создаётся необходимый вакуум (10 -5 - 10 -6 Па). Ускоряющее напряжение, прикладываемое между катодом и анодом, находится в пределах от 20 до 200 к. В, что обеспечивает режим работы «на просвет» . В РЭМ это напряжение значительно меньше (до 20 к. В). Весьма эффективно применение ПЭМ для анализа микроструктуры материалов, установление в ней нарушений, контроля правильности заполнения узлов кристаллической решётки, наличия пустот, дислокаций и т. д.

Двумерное электронное изображение кристалла Nb, полученное при 200 кэ. В ускоряющего напряжения и увеличении в 6. 000 раз. Черные точки соответствуют позициям атомов Nb, белые – каналам межатомного пространства

сканирующая электронная микроскопия Разновидность электронной микроскопии, в которой для зондирования исследуемой поверхности используется сканирование по ней сфокусированного пучка электронов. Для формирования изображения используется детектирование различных сигналов, включая вторичные электроны, обратно рассеянные электроны, рентгеновское излучение и ток через образец. Двумерная карта снимаемого сигнала и представляет собой изображение поверхности.

Сканирующий туннельный микроскоп Рассматривать отдельные атомы позволяет устройство, использующее квантовый эффект туннелирования — сканирующий туннельный микроскоп (СТМ). Сканирующий туннельный микроскоп не рассматривает, а «ощупывает» исследуемую поверхность: очень тонкая игла-зонд с острием толщиной в один атом перемещается над поверхностью объекта на расстоянии порядка одного нанометра. Электроны преодолевают вакуумный барьер между объектом и иглой — туннелируют, и между зондом и образцом начинает течь ток. Величина этого тока очень сильно зависит от расстояния между концом иглы и поверхностью образца — при изменении зазора на десятые доли нанометра ток может возрасти или уменьшиться на порядок. Перемещая зонд вдоль поверхности с помощью пьезоэлементов и отслеживая изменение тока, можно исследовать ее рельеф практически «на ощупь» .

Режимы сканирующего туннельного микроскопа • Используется либо перемещение на постоянной высоте, либо постоянство туннельного тока. Во втором случае цепь обратной связи поддерживает постоянное расстояние между зондом и поверхностью. Сигналом является вертикальное смещение зонда. Туннельный барьер остается постоянным. В режиме постоянной высоты расстояние от зонда до поверхности меняется, меняется туннельный ток. Сканирующий зонд показывает картину распределения атомов на поверхности.

Атомно-силовой микроскоп У СТМ есть одно важное ограничение: объектом исследования могут быть только металлы или полупроводники (напомним, что эффект основан на туннельном токе). Диэлектрики в СТМ «рассмотреть» не получится. Для их исследования разработчиками СТМ был предложен другой метод, названный сканирующей атомно-силовой микроскопией. Принцип его работы заключается в том, что на малых расстояниях между зондом и образцом действует сила, величина и направление которой зависят от зазора. Эту силу измеряют, закрепляя иглу зонда на упругом консольном подвесе (кантилевере) и определяя ее отклонение. С помощью атомно-силовой микроскопии можно изучать любые поверхности – независимо от того, являются ли они проводниками или диэлектриками.

Датчик, основанный на отклонении лазерного луча

Ближнепольная оптическая микроскопия Ближнепольный оптический микроскоп был изобретен вслед за сканирующим туннельным микроскопом сотрудником лаборатории IBM в Цюрихе Полем Дитером. Уникальность ближнепольной оптической микроскопии по сравнению с другими сканирующими методами состоит в том, что изображение строится непосредственно в оптическом диапазоне. Однако разрешение многократно превышает разрешение традиционных оптических систем. [8]

Принцип работы оптической ближнепольного оптического микроскопа Если в качестве зонда взять миниатюрную диафрагму с отверстием в несколько нанометров, то видимый свет (с длиной волны несколько сот нанометров) проникает в такое маленькое отверстие, но не далеко, а на расстояние, сопоставимое с размерами отверстия. Если в пределах этого расстояния, в так называемом «ближнем поле» , поставить образец, отраженный от него свет даст видимый аналоговый сигнал. Перемещая диафрагму в непосредственной близости от образца, как в туннельном микроскопе, получим поточечное изображение поверхности.

Сопоставление пространственного разрешения различных микроскопических методов: оптическая микроскопия (ОМ), растровая электронная микроскопия (РЭМ), просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ), сканирующая зондовая микроскопия (СЗМ)

Рентгеновская микроскопия Схема проекционного рентгеновского микроскопа с использованием широкофокусной рентгеновской трубки и камеры-обскуры.

Схема фокусировки рентгеновских лучей в отражательном рентгеновском микроскопе с 2 скрещенными зеркалами: OO' — оптическая ось системы; А — объект; A' — его изображение. Увеличение O'A'/OA.

Темнопо льная микроскопи я — вид оптической микроскопии, в которой контраст изображения увеличивают за счет регистрации только света, рассеянного изучаемым образцом. При использовании метода темного поля регистрируются даже незначительные различия в преломляющей способности участков препарата. Основы метода разработаны Р. Зигмонди в 1906 году. Схема темнопольной микроскопии в падающем свете. Подсветка образца осуществляется сбоку (зеленая линия). Изображение создается светом, рассеивающимся на неоднородностях образца.

Для прозрачных объектов возможно и контровое освещение, но при этом необходимы дополнительные действия, чтобы убрать "прямое поле. Это можно сделать, например, с помощью линзы и шаблона, закрывающего небольшой участок в плоскости, где линзой фокусируется "опорная" световая волна. Затем, с помощью второй линзы проводят обратное преобразование Фурье и наблюдают полученную картину визуально. При этом контраст исходного изображения существенно возрастает.

Волноводный оптический микроскоп Схема волноводного оптического микроскопа: 1– 3 – планарный оптический волновод; 1, 3 – кварцевые пластинки; 2 – жидкостный волноводный слой; 4 – иммерсия; 5 – кварцевая полусфера; Л – линза; ФД – фотодетектор; АЦП – аналого-цифровой преобразователь. На вставке вверху слева: статистический ансамбль модельных биологических микрообъектов, расположенных на поверхностях пластинок внутри волноводного слоя.

Конфокальная микроскопия — один из методов оптической микроскопии, обладающий значительным контрастом по сравнению с микроскопами классической схемы за счет использования диафрагмы, отсекающей поток фонового рассеяного света. В конфокальном микроскопе в каждый момент времени регистрируется изображение одной точки объекта, а полноценное изображение строится путем сканирования (движения образца или перестройки оптической системы). Для того, чтобы регистрировать свет только от одной точки после объективной линзы располагается диафрагма малого размера таким Повышение контраста образом, что свет, испускаемый изображения также достигается за анализируемой точкой , проходит через счет того, что осветитель создает диафрагму и будет зарегистрирован, а не равномерную освещенность свет от остальных точек в основном поля зрения, а фокусирует свет в задерживается диафрагмой. анализируемую точку.

Принципиальная оптическая схема поляризационного микроскопа: a - для ортоскопического наблюдения; б - для коноскопического наблюдения; 1 - поляризатор; 2, к - диафрагмы; 3 - конденсор; 4 - препарат; 5 - объектив; 7 - компенсатор; 8 - анализатор; 9 - линза Бертрана; 10 - фокальная плоскость окуляра; 11 - окуляр.

Поляризационная M. используется для исследования анизотропных объектов в поляризов. свете (проходящем и отражённом). У прозрачных объектов во MH. случаях наблюдают интерференц. явления (см. Интерференция поляризованных лучей), к-рые изучаются либо в параллельных лучах (ортоскопия), либо в сходящихся лучах (коноскопия). При ортоскопич. ходе лучей (рис. 8, а)в фокальную плоскость окуляра 11 проецируется изображение 4' препарата 4. Наблюдаемая при этом интерференция поляризов. лучей локализована в плоскости препарата. Пучок лучей, прошедших через поляризатор 1, ограничивается апертурной диафрагмой 2 конденсора 3; с помощью поворотного анализатора 8 и компенсаторов разл. типов 7 производится измерение величины двойного лучепреломления, углов поворота плоскости поляризации, определение углов погасания и др. характеристик. При коноскопич. ходе лучей (рис. 8, б)апертурная диафрагма 2 открывается, а наблюдение интерфоренц. картины, локализованной в бесконечности, производится с помощью линзы Бертрана 9, к-рая проецирует выходной зрачок 6 в фокальную плоскость 10 окуляра. Получаемые при этом изображения дают возможность определить знак двойного лучепреломления, кол-во осей объекта, их ориентацию и величину угла между осями.

Метод фазового контраста в проходящем свете: 1 - апертур-ная диафрагма; 2 - конденсор; 3 - препарат; 4 - объектив; 5 - фазовая пластинка; 6 - изображение. Фазово-контрастная M. используется для наблюдения прозрачных непоглощающих объектов, к-рые отличаются от окружающей среды показателями преломления или толщиной. Вследствие этого различия световая волна, прошедшая сквозь объект, претерпевает изменения по фазе и приобретает т. н. фазовый рельеф. Фазовые изменения, не воспринимаемые непосредственно глазом или фотопластинкой, с помощью спец. фазовой пластинки (фазового кольца) переводят в амплитудные изменения (амплитудный рельеф), воспринимаемые глазом как изменения интенсивности.

Препарат 3 в фазово-контрастном микроскопе (рис. 5) освещается через кольцевую апертурную диафрагму 1, установленную в переднем фокусе конденсора 2. Изображение её получается в заднем фокусе объектива 4, где помещается прозрачная пластинка 5 с фазовым кольцом, размеры к-рого равны размерам изображения диафрагмы. Фазовое кольцо представляет собой вытравленную в пластинке канавку или нанесённую на неё тонкую плёнку. Регулярный свет, прошедший через фазовое кольцо, сдвигается по фазе на(сплошные линии), а свет, дифрагировавший на объекте, не попадает в кольцо и не получает этого дополнит, сдвига по фазе (пунктирные линии). С учётом фазового сдвига, внесённого самим объектом, разность фаз между регулярной и дифрагировавшей волнами оказывается близкой к О или p, и эти волны интерферируют. В результате в плоскости 6 формируется контрастное изображение объекта, в к-ром распределение освещённости (рис. 1, б) приблизительно соответствует изменению показателя преломления (или толщины объекта). При малой разности фаз в объекте регулярные и дифрагиров. лучи сильно отличаются друг от друга по амплитуде. Поэтому для повышения контраста на фазовое кольцо наносится дополнит, поглощающее покрытие.

Метод интерференционного контраста: 1 - конденсор; 2 - среда, в которой находится объект 3; 4 - объектив; 5 - компенсатор. Принципиальная схема одного из способов осуществления интерференц. контраста показана на рис. 6. Конденсор 1 и объектив 4 снабжены двоякопреломляющими пластинками (помечены на рис. диагональными стрелками), первая из к-рых расщепляет исходный световой луч на два луча, а вторая воссоединяет их. Один из лучей, проходя через объект 3, запаздывает по фазе (приобретает разность хода по сравнению со вторым лучом, проходящим только через среду 2); величина этого запаздывания измеряется компенсатором 5. Метод интерференц. контраста в нек-рых отношениях сходен с методом фазового контраста: оба они основаны на интерференции лучей, прошедших через микрочастицу и миновавших её.