Мікроскопічні методи дослідження Мікроскопічні методи цитологічних досліджень

Мікроскопічні методи дослідження

Мікроскопічні методи цитологічних досліджень Світлова мікроскопія Електронна мікроскопія Метод світлого поля Метод темного поля Фазово-контрастна мікроскопія Інтерференційна мікроскопія Поляризаційна мікроскопія Флуоресцентна мікроскопія Конфокальна мікроскопія Трансмісійна (просвічуюча) мікроскопія Растрова (скануюча) мікроскопія Скануюча силова мікроскопія Тунельна Атомна силова мікроскопія Близькопольна оптична мікроскопія

Будова світлового мікроскопа ОПТИЧНА СИСТЕМА окуляр лінзи бінокулярної насадки та тубусів об’єктив МЕХАНІЧНА СИСТЕМА бінокулярна насадка, тубуси штатив предметний столик з препаратоводієм макрогвинт конденсор, ірисова діафрагма, фільтри джерело світла гвинт конденсора мікрогвинт основа

основа та дзеркальце тубус без окуляра

предметний столик з препаратоводієм предметний столик

револьверна голівка з об’єктивами макро та мікрогвинти

макрогвинт та мікрогвинт

конденсор і діафрагма предметний столік (знизу), конденсор, ніжки станіни

дзеркальце, конденсор

Аберації оптичної системи Монохроматичні Хроматичні Монохроматичні аберації – притаманні монохромним пучкам променів Сферична аберація – крапка передається у вигляді плями розсіювання. Як результат, знижується контрасність зображення. Астигматизм – крапка передається у вигляді плями розсіювання еліпсовидної форми

Кома (коматична аберація) – чіткість зображення знижується від центру до границі поля зору внаслідок порушення симетрії світлового пучка. У зображенні крапки спостерігається однобічна деформація Кривизна поля зображення – не дозволяє одночасно бачити чітко центр та краї поля зору.

«подушка» ідеальне зображення «бочка» Дисторсія – виникає, якщо порушується подібність між об’єктом та його зображенням з-за того, що лінійне збільшення у центрі та на краях поля зору різне.

Хроматичні аберації – виникають, коли зображення, створене промінням однієї довжини хвилі не співпадає з зображенням, створеним хвилямі з іншою довжиною. До хроматичних аберацій належать хроматизм положення, хроматизм збільшення та хроматичні різниці геометричних аберацій Хроматизм положення – зображення різних кольорів розташовується на неоднаковій відстані від оптичної системи (виникають кольорові облямівки). Хроматизм збільшення – зображення різних кольорів хоча й знаходяться в одній площині, але мають різні розміри.

Приклад складних фігур розсіювання при хроматичних абераціях

Приклади зображень з хроматичними абераціями

Хроматизм положення (1) та його корекція за допомогою ахроматичної лінзи (2)

Типи оптики: • Анастигматична оптика – без астигматизму • Апланатична оптика – без коми та сферичної аберації • Ортоскопічна оптика – без дисторсії

Звичайна двовипукла лінза Об’єктив типу апланат Об’єктив типу анастигмат

Класифікація об’єктивів за типом оптичної корекції: • Ахромати– виправлена сферична аберація, кома та хроматизм положення для двох довжин хвиль. • Апохромати (АПО, APO)– виправлена сферична аберація, кома, астигматизм, хроматизм положення для 3 -х довжин хвиль. • Планахромати та планапохромати (ПЛАН, Plan, PL)– пласке поле зору (тобто подолано кривизну поля зору), що важливо під час фотозйомки. Решта – як у ахроматов чи апохроматов.

Апохромат Планапохромат Стігмахромати (СХ) – тип планооб’єктивів. Оскільки стандартні планапохромати є дорогими, у робочих мікроскопах використовують так звані «економічні об’єктиви» . Це об’єктиви з поліпшеною якістю зображення по полю: стігмахромати (ЛОМО), ахростігмати (LEICA), СР-ахромати и ахроплани (CARL ZEISS). Семіпланати (Semi-Plan, SP) – об’єктиви, подібні до ахроматів в яких зменшена, але не повністю виправлена кривизна поля зору.

Планахромати різних збільшень (маркування: «PL» , «Plan» )

Ахромат (немає додаткових позначень) орієнтовне збільшення (60 -80 х) Числова апертура (А) Збільшення, крат Штатна довжина тубуса (мм) Позначення на об’єктиві (стандарт ISO) Штатна товщина покривного скла (мм)

Визначення орієнтовного збільшення за кольоровими смужками чорний – 1 х-1, 25 х сірий – 1, 6 х-2, 0 х коричневий – 2, 5 х-3, 2 х червоний – 4 х-5 х жовтогарячий – 6, 3 х-8, 0 х жовтий – 10 х-12, 5 х світло-зелений – 16 х-20 х темно-зелений – 25 х-32 х блакитний – 40 х-50 х синій – 60 х-80 х білий – 100 х-160 х

Імерсійні об’єктиви 1678 р. – Р. Гук висуває ідею імерсійної мікроскопії 1840 р. – Д. Б. Амічі виготовив перші імерсійні об’єктиви 1867 р. – Е. Гундлах конструює перший об’єктив для гліцеринової імерсії 1872 р. – К. Цейс запроваджує у виробницьтво водноімерсійні об’єктиви Е. Аббе. 1872 р. – К. Цейс запроваджує у виробницьтво масляноімерсійні об’єктиви Е. Аббе.

Кольорова смужка, що вказує на орієнтовне збільшення. Кольорова смужка, що вказує на тип імерсії без кольору – суха система чорний – масляна імерсія (МИ, Oil) білий – водна імерсія (ВИ, W) жовтогарячий – гліцеринова імерсія (ГИ/Glys) ( червоний – інший тип імерсії

Кольорова маркування всього напису на об’єктиві. чорний – базовий світлопольний об’єктив зелений – фазові об’єктиви червоний – поляризаційні об’єктиви

Позначення на об’єктиві: маркування типу оптичної корекції «Achr» (Achromat) – ахроматичний об’єктив «Аpo» (Аpochromat) АПО (АРО) - апохроматичний об’єктив Microfluar, Neofluar, NPL, Fluotar СФ , М-ФЛЮАР напівапохромати (мікрофлюари) об’єктиви з проміжними характеристиками. "Plan-Neofluar" система лінз виправляє викривлення площини та хроматичні аберації. ПЛАН-АПО, Plan-Apo, ПЛАН, PL, Plan-Achr, Achroplan – планоб’єктиви (відповідно планапохромати та планахромати) СХ – стігмахромат CP-achromat , «Achrostigmat» - поліпшений ахромат, полуплан

Позначення на об’єктиві: додаткові літерні маркування, що вказують на спеціальні методи дослідження Ф (Рh 2) – фазовий (цифра відповідає маркуванню на спеціальному конденсорі чи вкладишу П (Pol) – поляризаційна мікроскопія Л (L) – люмінісцентна мікроскопія ФЛ (Ph. L) – фазово-люмінісцентна мікроскопія ЭПИ (Epi, HD) – епіоб’єктив для роботи у відбитому світлі за методом темного поля ДИК (DIC) – диференціально-інтерференціонний контраст

Окуляри Гюйгенса застосовуються з ахроматами малих та середніх збільшень, планахроматами малих збільшень. Належать до двох підтипів: окуляр Гюйгенса та окуляр Рамсдена. Окуляр Гюйгенса. Дійсне збільшене зображення у окулярі Гюйгенса розміщується між його лінзами у площині діафрагми окуляра і розглядається як у лупу за допомогою верхнього скла. Окуляр Рамсдена. Весь цілком діє як лупа, і у ньому зображення препарату, яке дає об’єктив знаходиться під окуляром. Різновидами окулярів Гюйгенса є ортоскопічні та компланатичні окуляри різних фірм.

Компенсаційні окуляри застосовуються з різними апохроматичними об’єктивами, з ахроматичними об’єктивами великих збільшень та з планахроматичними об’єктивами середніх та сильних збільшень.

Гомалі – спеціалізовані об’єктиви для фотонасадок. Виправляють кривизну поля зору (не використовуються разом з планахроматами).

Основні характеристики мікроскопа Загальне збільшення (V) мікроскопа знаходять як результат множення збільшення об’єктива на збільшення окуляра та, (якщо мікроскоп бінокулярний) на збільшення бінокулярної насадки. V= Vоб× Vок× Vбн Числова (або нумерична) апертура (А) мікроскопа визначає здатність оптичної системи сприймати більшу чи меншу кількість світла. Числова апертура A= n × sina (А)

N - показник заломлення середовища між фронтальною лінзою об’єктива та покрівним склом. Nповітря = 1 (Апертура якісного сухого об’єктива – 0, 95) Nводи= 1, 33 N 74%гліцерину= 1, 43 Nкедрової олії= 1, 515 (Апертура масляно-імерсійного об’єктива – 1, 4) Nвазелинової олії = 1, 5 (для УФ-мікроскопії) Nмонобромнафтоліну = 1, 66 (для мікроскопії у відбитому світлі)

Синус половинного кута вхідного отвору об’єктиву: Якщо n=1 (повітря); a=90 , то sin 90 =1; A=1. Якщо n=1 (повітря); a=40 , то sin 40 =0, 64; A=0, 64. A якісного сухого об’єктива = 0, 95 sina

Принцип Кьолера. Конденсор також має апертуру. При налаштуванні мікроскопічної системи бажано, щоб апертрура конденсора дорівнювала апертурі об’єктива: Aоб. = Аконд. Якщо виконується умова: Aоб. = Аконд. 1 То рекомендовано використовувати повну імерсію. Освітлювальний пристрій Е. Аббе 1872 р.

Обмежені розміри оптичної системи мікроскопа та те, що світло зазнає дифракції у неоднорідному середовищі – одна з причин поганого зображення об’єкту. Зображення крапки – світле коло, оточене світлими та темними смугами

Роздільна здатність мікроскопа. Роздільна здатність мікроскопа – це найменша відстань між двома точками, при якій ці дві точки у мікроскопі будуть виглядати як два окремих об’єкти. Роздільна здатність самосвітніх точок обраховується за формулою: d = 0, 61 l n sin a = 0, 61 або, наближено: l А l d≈ 2

Деякі спеціальні випадки розрахунку роздільної здатності мікроскопа. Роздільна здатність для несамосвітніх точок: d= l n sin a = l А Роздільна здатність для конфокального мікроскопа: d = 0, 44 l n sin a = 0, 44 l А Довжина (l) та амплітуда (А) світлової хвилі Для електронної мікроскопії: l= h m. V або де h – стала М. Планка, m - маса електрона, V – швидкість, - різниця потенціалів.

Вплинути на довжину світлової хвилі можна завдяки використанню світлофільтрів. Нейтральні світлофільтри – знижують інтенсивність світла Матові світлофільтри – усувають нерівномірність освітлення поля зору. Селективні (кольорові) світлофільтри – додають контрастності Додаткові кольори: чистий червоний+синьо-зелений = білий чистий синій + жовтий = білий чистий зелений + пурпурний = білий Додаткові функції селективних світлофільтрів: зелений: при фотографуванні (посилення контрасту), фазовоконтрастній мікроскопії світло-синій – електричне світло схоже на денне (- жовті та червоні промені)

Корисне збільшення мікроскопічної системи. Vкорисне = 1000 × А при більшому збільшенні знижується рівень освітленості препарата Якщо об’єктив 90×, апертура А=1, 35 Vкорисне = 1000 × 1, 35 = 1350× Vок = 1350/90 = 15×

Глибина різкозті (глибина чітко зображуваного простору). Боке (від яп. ボケ (写真) боке — «нечіткість» ) – художній прийом створення нечіткості фонових деталей зображення

Глибина різкозті (глибина чітко зображуваного простору). T = 1000 7 AV + l 2 A 2 Де: Т - глибина чітко зображуваного простору (мкм) V – збільшення (крат) А – нумерична апертура l - довжина світлової хвилі (мкм) Якщо V=1350, А=1, 3 , то Т= ? Т= 0, 24 мкм

Деякі характеристики світлової хвилі Довжина та амплітуда Кольорові, амплітудні прозорі та непрозорі об’єкти Фаза коливань Площина поляризації Ізотропні та анізотропні об’єкти Фазові об’єкти

Деякі методи мікроскопії Метод темного поля Метод фазового контрасту Інтерференційна мікроскопія Мікроскопія забарвлених об’єктів Поляризаційна мікроскопія

Мікроскопія у темному полі або ультрамікроскопія виклористовує явище, відому як ефект Тиндаля Мінімальні розміри часток, видимих у при темнопольній мікроскопії залежать від освітлення і можуть досягати 2 нм (зазвичай 100 -200 нм). За дифракційними плямами неможливо визначити істинні розміри, форму, структуру часток, проте можна визначити наявність, концентрацію та рух часток. Для темнопольного методу рекомендовано застосовувати ахромати 8, 20, 40 крат та спеціальну імерсію для темного поля

Ефект Тиндаля Дрібний об’єкт у світлі, що проходить є невидимим Дрібний об’єкт у відбитому світлі, стає видимим

Темнопольний мікроскоп запропонували Р. Зігмонді та Р. Зідентопф у 1903 р. діафрагма Зігмонді параболоїд-конденсор Зідентопфа або кардіоїд-конденсор

Темнопольна мікроскопія звичайна світлова мікроскопія конденсор забезпечує бічне освітлення препарату діафрагма Зігмонді (вид згори) темнопольна мікроскопія

Поляризаційна мікроскопія Анізотропія – неоднаковість фізикохімічних властивостей середовища у різних напрямах в середині цього середовища. Причиною анізотропності є те, що при впорядкованому розтащуванні атомів, молекул чи йонів сили взаимодії між ними и міжатомні відстані виявляються неоднаковими у разних напрямках. Зміна світлового потоку в залежності від взаємного розташування двох поляризаторів Ізотропія – однаковість властивостей середовища у всіх напрямках.

Частина світла у оточуючому світі поляризована. Так частково поляризовано світло, що йде від хмар та неба. Застосовуючи поляризатор при фотографуванні можна добитися зміни яскравості та контрасту різних частин зображення. Так результатом зйомки пейзажу у сонячний день є темне, насичено синє небо. Максимальний ефект досягається при зйомці у напрямку перпендикулярному напрямку на сонце.

джерело світла ізотропний об’єкт неполяризоване поляризатор світло з дозволеною площиною поляризації неполяризоване світло анізотропний об’єктив світло не проходить крізь аналізатор з дозволеною площиною поляризації звичайний промінь не проходить крізь аналізатор, надзвичайний проходить

Поляризаційна мікроскопія аналізатор звичайна світлова мікроскопія поляризатор поляризаційна мікроскопія

Дослідження фазових об’єктів Інтерференційний мікроскоп 1 перший промінь проходить повз об’єкт, другий - через об’єкт, що досліджується Варіант 1. Дослідження НЕфазового об’єкта 2 Якщо об’єкт не є фазовим, при інтерференції променів амплітуда збільшується

Дослідження фазових об’єктів Інтерференційний мікроскоп 1 перший промінь проходить повз об’єкт, другий - через об’єкт, що досліджується Варіант 2. Дослідження фазового об’єкта 2 Якщо об’єкт є фазовим, при інтерференції променів амплітуда зменшується

Інтерференційний мікроскоп Р = r. S 100 a Формула О. О. Лєбєдєва (1932 р. ) дозволяє визначити масу речовини Р – маса речовини (г); r – величина фазового ссуву (см), S – площа об’єкта (см 2), a - константа (для білків – 0, 0018). В інтерференційному мікроскопі навколо коацерватних крапель видно інтерференційні кільця (за Т. Н. Євреіновою).

Дослідження фазових об’єктів Фазово-контрастна мікроскопія 1 – конденсорне кільце 2 – площина об’єкта 3 – фазова платівка 4 – первинне зображення фазова платівка у вигляді кільця поглинає частину світла та ссуває фазу на π/2 (назад) відносно незбурених променів. Об’єкт виглядає світлим на темному тлі (негативний фазовий контраст). При позитивному фазовому контрасті – випередження по фазі.

Клітина епітелію курчати у фазовоконтрастному мікроскопі Ф. Зерніке, сконструював фазовоконтрастний мікроскоп, 1953 р. отримав Нобелівську премію

Дослідження фазових об’єктів Фазово-контрастна мікроскопія фазова пластинка звичайна світлова мікроскопія кільцева діафрагма Зсуви по фазі світлових хвиль перетворюються у зміни амплітуди фазово-контрастна мікроскопія

Дослідження фазових об’єктів Диференційна інтерференційно-контрастна мікроскопія (мікроскопія Номарського, DIC)

Дослідження фазових об’єктів Дифференциальная интерференционно-контрастная микроскопия (мікроскопія Номарського, DIC) Шлях променів у мікроскопі Номарського (DIC)

Фазово-контрастне зображення діатомових водоростей (ліворуч) та DIC-зображення (праворуч). Відсутнє дифракційне гало.

Харова водорость Micrasterias furcata у DIC мікроскопі

Світле поле Метод фазового контрасту Інтерференційна мікроскопія Темне поле

Світле поле Поляризаційна мікроскопія Темне поле Метод фазового контрасту

Мікроскопи порівняння

Схема бінокулярної насадки

Бінокулярні лабораторні мікроскопи

Інвертований мікроскоп