Микроскопические методы анализа в лаборатории И. А. Новикова
Микроскопы Микроскоп (от греч. mikros — малый, skopeo — смотрю) — это прибор, позволяющий получать увеличенное изображение объектов и структур, недоступных глазу человека. В медицинских и биологических исследованиях применяют методы световой и электронной микроскопии.
Световая и электронная микроскопия Световые микроскопы могут увеличивать объект размером от 0, 5 мкм с разрешением элементов объекта до 0, 1 мкм более чем в 1 800 раз. Для освещения используют естественный свет или искусственные источники света. Электронная микроскопия делает возможным исследование объектов, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности светового микроскопа (менее 0, 2 мкм) и применяется для изучения вирусов, бактериофагов, тонкого строения микроорганиз мов и других субмикроскопических объектов и макромолекулярных структур. Обеспечивает увеличение объекта в 20 000 раз.
Виды микроскопических приборов 1. Биологические 2. 3. 4. 5. 6. микроскопы (проходящего света) Инвертированные биологические микроскопы (инвертированные микроскопы проходящего света) Люминесцентные микроскопы Поляризационные микроскопы проходящего света Стереоскоптические микроскопы Анализаторы изображения. По степени сложности каждую группу микроскопов делят на учебные; рутинные; рабочие; лабораторные; исследовательские.
Составные части микроскопа Основные функциональные части: Ш механическая Ш оптическая Ш осветительная система Механическая часть микроскопа: v Штатив (основание и тубусодержатель) v Предметный столик. Закреплен на специальном кронштейне. Предметные столики могут быть подвижными и неподвижными. Неподвижные столики применяют в самых простейших моделях микроскопов. При оснащении микроскопов подвижными столиками возможно механическое перемещение или управление от электродвигателя (сканирующий).
Схема устройства микроскопа
Оптическая часть микроскопа Обеспечивает его основную функцию, увеличенное изображение объекта. создавая Основные оптические элементы микроскопа объектив, окуляр, конденсор. Вспомогательные оптические элементы осветительная система, дополнительные насадки. По количеству объективов микроскопы могут быть v монокулярные v бинокулярные v тринокулярные и т. д. – Если непосредственно под микроскопом требуется выполнение каких либо работ, используются объективы с большим рабочим расстоянием (свободное расстояние между объективом и объектом).
Иммерсионные объективы Необходимое требование – использование иммерсионной жидкости: v для повышения разрешающей способности микроскопа v в соответствии с технологией микроскопирования v для повышения видимости за счет увеличения разности показателя преломления среды и объекта v для увеличения глубины просматриваемого слоя, (зависит от показателя преломления среды). Типы иммерсионных жидкостей: v масляная (МИ/Oil), v водная (ВИ/W) v глицериновая (ГИ/Glyc) (в основном применяют в ультрафиолетовой микроскопии).
Окуляры Окуляр — обращенная к глазу часть оптического прибора, предназначенная для рассматривания с некоторым увеличением изображения, созданного объективом прибора. Служит для построения микроскопического изображения на сетчатке глаза наблюдателя. Играет роль лупы, дополнительно увеличивающей изображение, созданное объективом. В общем виде окуляры состоят из двух групп линз: глазной и полевой (ближайшей к плоскости изображения). При необходимости микроскопических исследований, требующих проведения точных измерений, внутри окуляров располагают шкалы и сетки.
Осветительная система микроскопа Осветительная система — это система линз, диафрагм и зеркал (при необходимости), обеспечивающая равномерное освещение объекта и полное заполнение апертуры объектива. Включает: Шисточник света (естественный или искусственный); Школлектор — оптическая система, проецирующая нить лампы в плоскость апертурной диафрагмы конденсора. Вблизи коллектора расположена полевая диафрагма микроскопа. Шконденсор — оптическая система, которая проецирует полевую диафрагму коллектора в плоскость предмета, предназначена для увеличения количества света, поступающего в микроскоп.
Источники света при световой микроскопии Используется естественный свет либо искусственное освещение (лампы накаливания, галогенные, ртутные). В отечественных старых световых микроскопах используется лампа накаливания РН 8 20 1, а в современных микроскопах отечественного и зарубежного производства в основном галогеновые лампы, чаще всего фирмы «OSRAM» (Германия), с напряжением 6 В, мощностью 20 или 30 Вт. В исследовательских микроскопах применяют более мощные лампы — напряжением 12 В и мощностью 50 или 100 Вт.
Световые микроскопы Подразделяют: микроскопы плоского поля обеспечивают воспроизведение объекта в двухмерном пространстве — двухмерное плоское изображение. Можно просматривать объекты толщиной от 10 до 0, 1 мм, просматриваемый слой по высоте от 1, 0 до 0, 001 мм. стереоскопические (объемное или трехмерное изображение объекта). Позволяют рассматривать прозрачные и полупрозрачные объекты, объекты большого размера (от 100 до 1 мм). Просматриваемый слой по высоте (глубине) — от 50 до 0, 5 мм Микроскопы проходящего света плоского поля называют в отечественной литературе биологическими микроскопами.
Инвертированные микроскопы (перевернутое строение схемы микроскопа) - наблюдательная часть микроскопа (бинокулярная насадка с окулярами) расположена снизу объекта. Оптическая система расположена ниже предметного столика, а источник света — выше. Это обеспечивает возможность свободных микроманипуляций с объектом наблюдения. Используется для работы с культурами клеток.
Типы микроскопии в зависимости от принципов построения изображения Микроскопы светлого поля — на светлом фоне наблюдается более темное изображение объекта. Микроскопы с методом темного поля - применяют освещение под таким углом, чтобы световые лучи от осветителя не попадали в объектив. Наблюдаемые объекты становятся при этом видимыми как светящиеся точки на темном поле или контур объекта имеет ярко блестящий вид. Микроскопы с методом фазового контраста (фазово контрастная микроскопия) позволяют с максимальной степенью визуализации и детальности наблюдать на сером фоне более темное «объемное» изображение объекта, окруженное по контуру светлой полосой.
Люминесцентные микроскопы Обеспечивают возможность наблюдения на темном фоне свечения объектов под воздействием света. Первичная (собственная) флуоресценция свойство некоторых объектов при облучении светом с короткой длиной волны флюоресцировать на большей длине волны. Вторичная флюоресценция вызвана окрашиванием специфическими красящими веществами — флюорохромами. Преимущества люминесцентной микроскопии: v обеспечивает цветное свечение и высокую степень контрастности светящихся объектов v возможность исследования как прозрачных, так и непрозрачных живых объектов С помощью люминесцентных микроскопов проводят фенотипический анализ клеток периферической крови, костного мозга и тканей по наличию поверхностных антигенов с применением моноклональных антител.
Поляризационные микроскопы Обеспечивают наблюдение на сером или темном фоне разноцветного, четкого или контрастного изображения. Обычный прямо проходящий свет с помощью полярофильтров поляризатора в осветительной системе превращается в имеющий одно преимущественное направление линейно-поляризованный свет. Преимущества: Ш высокая степень контрастности и четкости изображения в поляризованных лучах; Ш визуализация объектов, невидимых в обычном свете и обладающих свойством анизотропии (двойного лучепреломления). Анизотропные структуры (с упорядоченным расположением молекул - кристаллы, фибриллярные белки) становятся видимыми как ярко светящиеся на темном фоне. Применяют при анализе состава почечных и желчных камней, гистологических срезов и др.
Лазерные микроскопы Позволяют сканировать объект в трех измерениях и с помощью компьютера, сопоставляя до 20 срезов в разных позициях, формировать трехмерное изображение объекта, не давая, однако, точной цветопередачи. Предназначены для исследования объектов в трехмерном изображении на уровне разрешения, приближенного к электронной микроскопии с помощью лазерной системы, состоящей из 3 — 4 лазеров и комплексной системы светофильтров.
Преаналитический этап при микроскопии Необходимо соблюдение техники приготовления мазка: тонкий, монослойный, без повреждения клеток, обеспечивающий раздельное расположение клеток Автоматические устройства для приготовления равномерных мазков: v Центрифугирование. Цитоцентрифуга концентрирует клетки на небольшой площади, и такие мазки используют для изучения клеток в низких концентрациях, например в спинномозговой жидкости. v Механическое распределение клеток с помощью специальных устройств. Требуют применения стандартных стекол. Предусмотрено в современных гематологических анализаторах.
Фиксация мазков Фиксация необходима для придания клеткам стойкости к воде, содержащейся в краске, а также для коагуляции белка, что обеспечивает прикрепление клеток к стеклу. Наиболее широко используемые фиксаторы: vметанол vэтанол v 10 % формалин и лиофилизация для фиксации срезов тканей, vглутаровый альдегид (0, 5 % и 0, 2 % растворы). для препаратов, исследуемых под электронным микроскопом
Окраска мазков Позволяет изучить морфологию клетки. Основана на химическом сродстве основных частей клеток к определенным анилиновым краскам. Структуры, содержащие щелочные компоненты, воспринимают кислые компоненты красок и наоборот. Ядра в значительном количестве содержат нуклеиновую кислоту и окрашиваются главным образом основными красками.
Особенности окраски мазков крови Основные гематологические краски: Ш метиленовый синий и его производные азур 1 (метиленазур) и азур 2 (смесь равных частей азура I и метиленового синего) – основная составляющая Ш водорастворимый желтый эозин – кислая составляющая Азур-эозиновые смеси обладают высокой чувствительностью к реакции красящей среды, поэтому применяемая для приготовления красящих растворов и для смывания их дистиллированная вода должна иметь нейтральную реакцию. При кислой реакции воды клетки долго не прокрашиваются и имеют красный оттенок, а при щелочной (чаще всего причиной щелочной реакции являются стекла, плохо отмытые от моющих средств) — эритроциты окрашиваются в серовато-синий цвет, а ядра и цитоплазма клеток — в очень темные тона.
Анализаторы изображения Компьютерные, или цифровые, микроскопы состоят из микроскопа с тринокуляром, средств ввода изображений (камера цифровая либо цифровой фотоаппарат, плата ввода — так называемый фрейм граббер), компьютера и программного обеспечения. Принципы работы компьютерных микроскопов: Ш изображение поля зрения микроскопа при помощи камеры и фрейм граббера отображается на экране монитора; Ш по указаниям врача изображение, выведенное на экран, запоминается в памяти компьютера вместе с сопровождающей его текстовой информацией; Ш вся информация, ранее занесенная в память компьютера, может быть вызвана, передана по электронным сетям, отредактирована, распечатана; Ш при выполнении количественных анализов изображения подвергают компьютерной обработке с определением различных геометрических, цветовых, структурных, плотностных (текстурных) и других признаков
БЛАГОДАРЮ ЗА ВНИМАНИЕ !!!
Скачать презентацию Микроскопические методы анализа в лаборатории И А Новикова
Микроскопические методы анализа в лаборатории.ppt