Микрофлора мочеполового тракта Результаты исследования вагинального биоценоза в практике врача - дерматовенеролога И. Г. Афанасьева кафедра дерматовенерологии ФПК И ППС Иркутский государственный медицинский университет, г. Иркутск Конференция 12. 04. 2011.
НЕВИДИМЫЙ ОРГАН МИКРОФЛОРА ЧЕЛОВЕКА
Введение n До недавнего времени существовали значительные ограничения в изучении микробиологических сообществ. Главные из них: u недостаточная дискриминация микроорганизмов по морфологическим признакам; u cложности в культивировании микроорганизмов. большинства n Внедрение молекулярно-биологических методов позволило открыть большое число новых микроорганизмов, расширить, упорядочить, а в некоторых случаях пересмотреть знания о таксономии. 3 ПЦР - это ДНК-Технология 16 March 2018
Микрофлора влагалища История вопроса ü 1836 г. – Donne (Trichomonas vaginalis) ü 1842 г. – Sherer (микроскопия лохий) ü 1861 -1863 гг. – Луи Пастер (vibrion butirique) ü 1865 г. – С. Mayerhofer (послеродовые заболевания) ü 1890 г. – А. И. Замшин (заражение животных) ü 1893 г. – В. В. Строганов (диссертация) 4 ü 1895 г. – А. Додерлейн (классический труд) 16 March 2018
ВАГИНАЛЬНАЯ ЭКОСИСТЕМА ВЛАГАЛИЩЕ ЭКОСИСТЕМА ВАГИНАЛЬНАЯ СРЕДА ВАГИНАЛЬНАЯ МИКРОФЛОРА
Видовой состав микрофлоры факультативна я облигатная транзиторная Нормальная микрофлора влагалища
• • • • Гарднереллы Превотелы Порфиромонады Эубактерии Снитии Лептотрихии Фузобактерии Мегасферы Вейлонеллы Диалистеры Лахнобактерии Клостридии Мобилункусы Пептострептококки Вагинальный Бактерии-ассоцианты БВ • Энтеробактерии • Стрептококки • Стафилококки Облигатные анаэробы сключительно факукультативные анаэробы Видовой состав микрофлоры • • Эубактерии Гарднереллы Лептотрихии Фузобактерии Снитии Мобилункусы Пептострептококки • Вагинальный атопобиум
Микрофлора влагалища § В норме основным компонентом являются лактобактерии § p. H 3, 8 – 4, 5 8 16 March 2018
Функции нормальной микрофлоры 9 16 March 2018
Нарушения вагинального биоценоза n n Нарушения вагинального биоценоза связаны с вагинитами и вагинозами. Устойчивость обусловлены: биоценоза к воздействиям u u составом биоценоза (вагинальной микрофлоры); u 10 генетическими факторами связанными с функционированием иммунной системы, прежде всего врожденного иммунитета; внешние факторы (Life. Style) 16 March 2018
Номенклатура бактериального вагиноза • 1892 г. – неспецифический вагинит • 1955 г. – неспецифический бактериальный вагинит • 1955 г. – гемофильный вагинит • 1963 г. – коринебактериальный вагинит • 1980 г. – гарднереллезный вагинит или гарднереллез • 1982 г. – неспецифический вагиноз • 1982 г. – анаэробный вагиноз • 1983 г. – бактериальный вагиноз • 1994 г. – вагинальный бактериоз • 1994 г. – вагинальный лактобациллез Аминокольпит, аминовагинит, влагалищные выделения с 11 ключевыми клетками 16 March 2018
Баквагиноз причина n Причина возникновения не ясна. Считается, что из-за снижения количества снижается? лактобактерий, q При снижении количества «замкнутый круг» : но почему лактобактерий оно возникает Снижение кол-ва лактобактерий Уменьшение продукции H 2 O 2 Рост ассоциированных с баквагинозом бактерий 12 ПЦР - это ДНК-Технология Повышение p. H 16 March 2018
Как задача постановки диагноза врачом решается сейчас § Врач u Осмотр u Жалобы u Микроскопия неокрашенного мазка § Лаборатория u Посев на флору u Микроскопия окрашенных мазков n n u ПЦР n 13 По Граму Метиленовым синим Качественная оценка условных патогенов 16 March 2018
Недостатки существующего подхода § Посев на флору u Длительные сроки культивирования, повышенные требования к транспортировке и хранению материала u Не все типы микроорганизмов растут равномерно – в процессе роста теряется соотношение между ними u Ограниченный спектр выявляемых микроорганизмов u Отсутствие возможности культивирования большинства анаэробов u Повышенные требования к лаборатории 14 16 March 2018
Недостатки существующего подхода § Микроскопия мазка § Субъективность оценки (изменчивость микроорганизмов, необходимость диагностировать много морфотипов) § Не все микроорганизмы видны в световой микроскоп § ПЦР качественными методами § Не дает представления о соотношении микроорганизмов между собой § Ограниченный спектр выявляемых микроорганизмов § Нет количественной оценки 15 16 March 2018
Микроорганизмы урогенитального тракта женщины Патогены В норме отсутствуют Качественная диагностика «есть» / «нет» Нормофлора Другие Грибы В норме присутствуют в большом количестве Могут присутствовать в малом количестве Необходимость количественной оценки
Анализ условно-патогенных микроорганизмов v Врачу необходима информация о состоянии биоценоза в целом: u Информация о соотношении общей обсемененности урогенитального тракта, лактобактерий и различных групп микроорганизмов является ключевой при оценке состояния биоценоза и, как следствие, состояния пациентки u 17 Важна количественная оценка групп микроорганизмов, что позволит оценивать динамические изменения состояния биоценоза ПЦР - это ДНК-Технология 16 March 2018
Подход к разработке диагностической системы Ø По литературным данным более 100 различных видов микроорганизмов могут входить в состав биоценоза УГТ у женщин Ø Эти микроорганизмы можно сгруппировать по признаку генетического родства Ø Для выявления этих групп и были разработаны реагенты 18 16 March 2018
Подход к разработке диагностической системы Колоссальное видовое разнообразие, отсутствие возможности культивирования большинства микроорганизмов и вирусов (компоненты сред, требования к поверхности, ингибиторы роста, комбинация температуры, давления кислотности, состава атмосферы, накопление токсических продуктов метаболизма, низкая скорость роста, контактное торможение) Необходимо идентифицировать специфические микробные сообщества в их естественной среде обитания без культивирования 19 16 March 2018
Дополнительно: u Выявление Atopobium vaginae регламентировано приказом МЗ РФ N 64 от 21 февраля 2000 г. Раздел микробиологические исследования условнопатогенные облигатные анаэробные микроорганизмы. 20 16 March 2018
Что такое Фемофлор? Высококлассный метод для исследования УГТ у женщин, позволяющий анализировать состояние биоценоза в целом, оценивать соотношение микроорганизмов между собой. u Многофакторный (23 группы микроорганизмов, 25 показателей) u Уникальный по составу выявляемых микроорганизмов u Количественный u Точный n Высокая аналитическая чувствительность n Высокая аналитическая специфичность u Наглядный u Быстрый и несложный в использовании (стандартные методики выделения ДНК и ПЦР амплификации) u Наличие готовых файлов с программами для ДТ-96 – 21 16 March 2018 исключение ошибок и потери времени
Состав комплекта реагентов «Фемофлор» u u u Общая бактериальная масса Лактобактерии Аэробные микроорганизмы (факультативные анаэробы) Анаэробные микроорганизмы Микоплазмы Грибы Количественная оценка 15 групп микроорганизмов Контроль взятия материала u Контроль прохождения реакции u Контроль качества проведенного анализа
Показания к анализу Исследования биоценозов УГТ женщин репродуктивного возраста u Жалобы без клинических проявлений (V, C, U? ) u Случаи несовпадения клиники и лабораторных исследований u Повторные обращения после лечения u Оценка эффективности проведенного лечения u Оценка восстановления нормофлоры u Оценка объема предполагаемой терапии Исследования биоценозов женщин в менопаузе 23 16 March 2018
Как правильно сделать забор материала 24 16 March 2018
Дополнительные лабораторные исследования: u Исследование мазка на лейкоциты u Качественный ПЦР анализ на безусловные патогены (хламидия, гонорея, микоплазма гениталиум) Medicus Amicus #2, 2006, http: //www. medicusamicus. com/index. php? umonth=9&action=1 x 856 -2 -4 a-5 a-13 gx 2 25 16 March 2018
Фемофлор § Получен патент на изобретение: § № 2008 105 063 от 13. 02. 2008 § «Способ диагностики дисбаланса микробиоты различных биотопов человека и степени его выраженности» § РУ ФСР 2009/04663 26 16 March 2018
Пример бланка выдачи результатов Абсолютные количественные значения Цветовая кодировка % соотношение между ОБМ и условнопатогенными микроорганизмами Заключение 27 ПЦР - это ДНК-Технология 16 March 2018
Состав комплектов реагентов Группа Выявляемые показатели Фемофлор 4 Фемофлор 8 Фемофлор 16 ● 2 Lactobacillus spp. / ВК ● ● ● Сем. Enterobacteriaceae ● ● 4 Streptococcus spp. ● ● 5 Staphylococcus spp. Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/ Porphyromonas spp. ● ● ● Eubacterium spp. ● ● Sneathia spp. /Leptotrihia spp. /Fusobacterium spp. 9 Megasphaera spp. /Veilonella spp. /Dialister spp. ● 10 Lachnobacterium spp. /Clostridium spp. ● 11 Грибы ● 8 Группа Микоплазм 28 ● 7 Анаэробные микроорганизмы Общая бактериальная масса 6 Аэробные микроорганизмы 1 3 Диагностика нормоценоза Mobiluncus spp. /Corynebacterium spp. ● 12 Peptostreptococcus spp. ● 13 Atopobium vaginae ● 14 Mycoplasma (hominis +genitalium ) ● ● 15 Ureaplasma (urealyticum + parvum) 16 Candida spp. /контроль взятия материала ● ● ● 16 March 2018 ●
Количественное исследование § Для исключения ложноотрицательных результатов предусмотрен контроль взятия материала § Интерпретации подлежат результаты со значением контроля взятия материала более 104 (4 Log) § При КВМ менее 104 (4 Log) необходимо связаться с врачом для выяснения состояния пациента или дополнительно взять материал 29 16 March 2018
Оборудование и программное обеспечение 30 Детектирующий термоциклер ДТ-96, «ДНК-Технология» 16 March 2018
Возможности настройки системы выдачи результатов 1. Изменение уровня отсечки ( Log) 2. Абсолютный и относительный анализ 3. Возможность анализировать результаты по отдельным группам организмов, выставляя индивидуальный уровень отсечки для каждого из них 31 ПЦР - это ДНК-Технология 16 March 2018
Цветовые границы нормофлоры 32 ПЦР - это ДНК-Технология 16 March 2018
Инновационность предлагаемого подхода (1): Чувствительный «инструмент» с возможностью настройки под решаемую задачу, обследуемую группу пациентов, конкретного врача u Возможность количественной оценки различных групп микроорганизмов и выявление соотношений между ними u Выявление труднокультивируемых облигатно-анаэробных грамположительных бактерий (Atopobium vaginae), облигатно-анаэробных грамотрицательных бактерий (Prevotella, Veilonella spp, Porphyromonas spp, Fusobacterium spp, Eubacterium spp, Sneathia, Leptotrichia, Megasphaera, Dialister, Lachnobacterium) u Выявление групп микроорганизмов, диагностика которых методом ПЦР до сих пор не была представлена u Возможность проведения динамических наблюдений u Возможность проведения научных исследований (в том числе и популяционных) u 33 ПЦР - это ДНК-Технология 16 March 2018
Инновационность предлагаемого подхода (2): u u u 25 параметров анализа (для Фемофлор 16) Контроль взятия материала Исследование нормофлоры Количественное исследование всех параметров Программное обеспечение, максимально облегчающее работу врача лаборанта: n n n 34 отчет о проведенном исследовании выдается программой в доступной для анализа врача-клинициста форме готовый файл загрузки (Фемофлор. ini) с программой амплификации, что существенно экономит время и исключает ошибки ручного программирования прибора (ДТ-96) определение положения стрипа в термоблоке, позволяющее исправить допущенные ошибки при установке стрипов ПЦР - это ДНК-Технология 16 March 2018
Апробация реагентов прошла в следующих лабораториях: 1. НИИ Акушерства и гинекологии им. Отта (СПБ) 2. ЦНИИА и Г им. Кулакова (Москва) 3. УРНИИ Дерматовенерологии (Екатеринбург) 4. ДЦ Гармония (Екатеринбург) 5. Центр новых мед технологий (Новосибирск) 6. ДНК-Диагностика (Барнаул) 7. ДЦ (Бийск) 8. Ассоциация независимых клинико-диагностических лабораторий «Ситилаб» (Казань) 9. …. 35 ПЦР - это ДНК-Технология 16 March 2018
Больная Р. 1970 г/р Жалобы: Выделения, дискомфорт, запах. Считает себя больной в течение года Микроскопия: Лейкоциты “V”до 10 п/з Лейкоциты “C” до 40 п/з Ключевые клетки -100% Обильная, кокко-бациллярная флора; Посев: обн ur >104 mh>104 выделения обильные, беловатые свободные, застойная гиперемия вагины, вульвы В зеркалах: Обильные густые молочнозеленоватые выделения без запаха, р. Н 4 Заключение: выраженный дисбаланс. Доля анаэробной микрофлоры превышает долю лактобактерий отн. ОБМ. М. и U. присутствуют в количествах, имеющ. диагностическое значение
Больная Г. 1987 г/р Жалобы: Отсутствуют. Обследование по поводу хламидиоза у партнера Микроскопия: Лейкоциты “С”до 20 -40 п/з Лейкоциты “V” до 10 -20 п/з Ключевые клетки -0% Смешанная Почкующийся мицелий единич Гиперемия влагалища вульвы, ш/м, р. Н 5, В зеркалах: Скудные зеленоватые выделения без запаха. Качественная ПЦР: Chlamydia trachomatis – ОБНАРУЖЕНА В посеве: U. u + U. p < 104 ; M. h. отр D-z: УГХ, УГК Заключение: умеренный дисбаланс
Больная Е. 1977 г/р Жалобы: Боли внизу живота. Микроскопия: Лейкоциты “V”до 10 п/з Лейкоциты “C” до 40 п/з Смешанная, коккобациллярная флора В зеркалах: Молочно-зеленоватые выделения в умеренном количестве, р. Н 5, без запаха Заключение: Аэробный дисбаланс
39 ПЦР - это ДНК-Технология 16 March 2018
40 ПЦР - это ДНК-Технология 16 March 2018
Анаэробный баланопостит • Gardnerella vag. • Bacteroides spp. • Fusobacterium spp. • Вагинозассоциированная группа анаэробов (чаще всего mobiluncus spp. и Atopobium vaginae) 41 ПЦР - это ДНК-Технология 16 March 2018
42 ПЦР - это ДНК-Технология 16 March 2018
Что анализ дает врачу: u u u 43 Оценка биоценоза в целом Более информативен, т. к. позволяет проводить сравнение количества бактериальной массы с лактобактериями – определение объема назначаемой терапии Выявляет микроорганизмы, которые не видны в микроскоп или не растут на питательных средах – определение этиологии инфекционного процесса Возможность проведения динамических наблюдений Анализ гораздо быстрее - результаты могут быть получены в течение суток 16 March 2018
Что анализ дает пациенту u Полная и информативная диагностика за 1 визит к врачу u Анализ позволит пациенту избежать избыточного лечения (полипрогмазии) u Индивидуально подобранная терапия Индивидуально терапия для каждого пациента u Возможность контролировать проведенное лечение и восстановление нормальной флоры 44 16 March 2018
Изменения в составе набора Уважаемые коллеги! Сообщаем, что произошли изменения в составе набора реагентов Фемофлор. С 1 мая 2010 г. вместо Микоплазма spp. будет регистрироваться отдельно Микоплазма хоминис и гениталиум по двум разным каналам 46 16 March 2018
Преимущества 1. Точный 2. Быстрый 3. Высокоспецифичный 4. Выбор правильной терапии 5. Контроль эффективности терапии 6. Прост и удобен в исполнении 46 7. Есть контроль взятия материала 16 March 2018
В любую непогоду, Когда грустно и не все получается ПОМНИТЕ, что у нас есть те, кто заботится о нас каждую секунду – ЭТО НАШИ ДРУЗЬЯ НОРМОБИОТЫ!!! 47 ПЦР - это ДНК-Технология 16 March 2018
Спасибо за внимание! 46 16 March 2018
Скачать презентацию Микрофлора мочеполового тракта Результаты исследования вагинального биоценоза в
abfd75a134d94495cea2c3f74960ec85.ppt