Микроэррей чипы и их использование в биологии растений

Микроэррей чипы и их использование в биологии растений Выполнили студентки 4 курса 4 группы Бачище Татьяна Колодич Дарья

Историческая справка: • Технология микромножества развилась из Саузерн блоттинга (от англ. Southern blot) — метод, применяемый в молекулярной биологии для выявления определенной последовательности ДНК в образце. • Понятие микроэррей было сначала предложено в конце 1980 -х Аугенлихтом и его коллегами. Они определили 4000 последовательностей комплементарной ДНК на клеточной мембране и использовали радиоактивную маркировку, чтобы проанализировать различия в образцах экспрессии гена среди различных типов опухолей на различных стадиях развития. Sir Edwin Southern Sir Steve Fodor • Стив Фодор разработал сканер для чтения продукции. • Марк Шена был объявлен как “Отец технологии микроэррей”. Mark Schena

Что такое МИКРОЭРРЕЙ? метод анализа экспрессии большого числа генов (от нескольких десятков до нескольких десятков тысяч), заключающийся в использовании фиксированных на твердом носителе (чипе) в определенном порядке большого числа строго определенных проб (олигонуклеотидов или олигопептидов), с которыми осуществляется взаимодействие или сложной анализируемой смеси к. ДНК, белков, или их антител.

Типы микроэррей • Микроэррей ДНК, такие как комплементарная ДНК, олигонуклеотидный Микроэррей, SNP Микроэррей • MMChips, для наблюдения micro. RNA • Пептидный миикроэррей, для подробных анализов или оптимизации взаимодействий белок – белок • Микроэррей ткани • Клеточные Микроэррей • Микроэррей химического соединения • Микроэррей антител • Микромножества фенотипа

По типу конструкции можно выделить следующие типы микроэррей чипов ØPrinted (spotted) microarrays

ØIn-situ synthesized

ØHigh-density bead arrays

ДНК-микрочипы используют для анализа изменения экспрессии генов, выявления однонуклеотидных полиморфизмов, генотипирования или повторного секвенирования мутантных геномов. Микрочипы отличаются по конструкции, особенностям работы, точности, эффективности и стоимости.

Принцип технологии ДНКчипов • Принцип технологии ДНКчипов основан на факте, что дополнительные последовательности ДНК могут использоваться, чтобы скреститься, с молекулами ДНК, расположенные на чипе. • Есть четыре главных шага в выполнении типичного эксперимента микроэррей. Типовая подготовка и маркировка Гибридизация Очистка Сбор изображений и анализ данных

Типовая подготовка и маркировка • Сначала необходимо выделить РНК. • Затем путем обратной транскрипции с участием РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы) с матрицы РНК копируется комплементарная ДНК (к. ДНК). • Далее из двух образцов к. ДНК готовятся различно окрашенные флуоресцентные пробы. Для этого, как правило, используют зеленые и красные флуорофоры: Су3 (излучение соответствует зеленой части спектра) и Су5 (излучение соответствует красной части спектра).

Гибридизация GATC ATGC SCANNED When green laser comes, When red laser comes, Merged image : TCAG

После анализа гибридизации получаем следующую картинку:

Сбор изображений и анализ данных Гибридизация анализируется при помощи флюоресцентного лазера ЗЕЛЕНЫЙ представляет ДНК Контроля, где или ДНК или комплементарная ДНК, полученная из нормальной ткани, скрещены к целевой ДНК. КРАСНЫЙ представляет Типовую ДНК, где или ДНК или комплементарная ДНК получены из больной ткани, скрещенной к целевой ДНК. ЖЕЛТЫЙ представляет комбинацию Контроля и Типовой ДНК, где оба скрестились одинаково к целевой ДНК. ЧЕРНЫЙ представляет области где ни Контроль, ни Типовая ДНК, не скрещенная к целевой ДНК.

Наиболее популярная платформа для оценки экспрессии генов - микрочипы Affymetrix Gene. Chip, использующие короткие последовательности олигонуклеотидов для выявления генов, содержащихся в образце РНК.

ПРИМЕНЕНИЕ МИКРОЭРРЕЙ ТЕХНОЛОГИИ

Микроэррей как инструмент профилирования экспрессии генов • Принципиальная цель использования технологии микрочипов как инструмент профилирования экспрессии генов является ответить на некоторые из фундаментальных вопросов в биологии, таких как "когда, где, и какие экспрессируются интересные нам гены. • Микроэррей анализ помогает лучше понять о регуляторных механизмов и широкой биоактивности функций генов. • При помощи чипов возможно сравнивать гены в больных и здоровых клетках, а также анализируя ответ клеток воздействию наркотиков или различных физиологических условий.

Микроэррей в качестве сравнительного инструмента геномики • Микроэррей технологии имеют широкое применение в сравнительном анализе генных мутаций для анализа геномных изменений, таких как последовательности и одиночные нуклеотидные полиморфизмы. • Для определения мутации • Для изучения геномной нестабильности, например, в некоторых видов рака и опухолей (генные амплификации, транслокации, делеции)

Диагноз болезни • Различные типы рака были классифицированы на основании органов, в которых опухоли развиваются. • Теперь, с развитием технологии микрочипов, можно будет исследовать, чтобы дополнительно классифицировать типы рака на основе генной активности в опухолевых клетках. • Также микроэррей чипы используются для анализа возбудителей заболеваний (быстрое генотипирование)

Применения в изобретении лекарства При помощи микроэррей чипов возможно: • Определить соответствующие молекулярные мишени для терапевтического вмешательства (маленькая молекула / белки) • Монитор изменения в экспрессии генов в ответ на медикаментозное лечение (вверх / вниз регулирование) • Анализировать группы больных (SNP) и ответ • Подбирать индивидуализированные методы лечения • Выбор препаратов с наименьшими возможными побочными эффектами

Токсикологические исследования • Микроэррей технология обеспечивает надежную платформу для исследования воздействия токсинов на клетки и их прохождения по потомству. • Токсикогеномика устанавливает корреляцию между ответами на токсикантов и изменения генетических профилей клеток, подвергшихся воздействию таких токсикантов. • Микрочип позволяет исследователям изучить тысячи различных генов в одном эксперименте и, таким образом, чтобы получить хорошее представление об относительных уровней экспрессии между различными генами в организме.

Уже на сравнительно ранних стадиях применения ДНК- микрочипов в биологии, их активно стали применять и в физиологии растений для исследования целого набора вопросов: циркадных ритмов, защиты растений, ответов на холодовой стресс и засуху, развития семени, сигнальной системы фитохрома А и ряда других не менее актуальных проблем.

Спасибо за внимание