Микрочиповые аналитические системы 2 Микрочипы миниатюрные устройства

Микрочиповые аналитические системы 2 Микрочипы – миниатюрные устройства планарной геометрии, в которых создана разветвлённая сеть микроканалов и микрореакторов, предназначенная для проведения аналитических операций в микрофлюидных потоках жидкости или в стационарных реакционных объёмах. ДОСТОИНСТВА МИКРОЧИПОВЫХ АНАЛИТИЧЕСКИХ СИСТЕМ: üСокращение расхода проб и реагентов üВозможность интеграции нескольких стадий анализа в одном устройстве ü Ускорение протекания процессов теплопереноса и массопереноса üВозможность параллельного анализа нескольких образцов ü Перспективы создания портативных аналитических приборов ü Высокая воспроизводимость микрочипов при массовом производстве Стеклянный чип ИФА Полимерный чип ПЦР Стеклянный чип Изучение кинетики реакций Кремниевые чипы Пробоподготовка

3 Микрочиповые аналитические системы для исследовательских задач • Высокая производительность (>1000 образцов) • Мультиплексная ПЦР-РВ • Минимальные пределы обнаружения ü • Низкое быстродействие • Высокая стоимость микрочипа • Необходимость отмывки при многоразовом использовании • Сложность ввода проб в микрореактор • Частичная лиофилизация ПЦРреактивов û для экспрессного анализа • Высокое быстродействие ü • Малая производительность (1 -5 образцов) • Высокая стоимость микрочипа • Не реализована мультиплексная ПЦР • Сложность ввода проб в микрореактор • Не реализована лиофилизация ПЦРреактивов û

Микрочиповые аналитические системы Высокое быстродействие Оптимальная производительность 4 Снижение времени анализа Наиболее востребованная производительность (15 -50 образцов) Минимальные пределы обнаружения Повышение аналитических характеристик Низкая стоимость микрочипа Одноразовое использование Мультиплексная ПЦР Повышение производительности и достоверности результатов Простой ввод проб в микрореакторы Внедрение в практику и замещение существующего оборудования Лиофилизация всех ПЦР реагентов Исключение трудоемкой и длительной стадии приготовления растворов Длительные сроки хранения микрочипов Повышение достоверности результатов

Цель работы Разработка методологии молекулярногенетического анализа в микрочиповых аналитических системах, выбор и обоснование принципиальных схем микрочиповых анализаторов, удовлетворяющих требованиям аналитической практики: высокочувствительному, воспроизводимому и экспрессному определению нуклеиновых кислот, и подтверждение их работоспособности на модельных и реальных пробах 5

Задачи 1. 2. 3. 4. 5. Обосновать схемы и выбрать необходимые условия осуществления реакций молекулярно-генетического анализа в микрочиповых аналитических системах. Выбрать материал, обеспечивающий выполнение условий проведения аналитических реакций и выявить основные закономерности влияния его характеристик на проведение ПЦР в микрореакторах. Оптимизировать схемы и режимы работы микрочиповых аналитических систем по их параметрам, влияющим на правильность, воспроизводимость измерений, динамический диапазон сигнала, метрологические характеристики разрабатываемых методов. Разработать микрочиповые анализаторы нуклеиновых кислот с полным циклом регистрации, сбора и обработки данных для аналитической практики. Разработать методики определения нуклеиновых кислот с помощью созданных микрочиповых анализаторов и оценить их возможности для решения практических задач молекулярно-генетической диагностики. 6

Молекулярно-генетические методы анализа 1. Пробоподготовка – выделение и очистка ДНК/РНК Исходным материалом для получения ДНК могут служить любые микроорганизмы, содержащие нуклеиновые кислоты (лейкоциты периферической крови, ткани животных и растений, бактерии, вирусы, споры). Для одного анализа необходимо всего несколько копий ДНК/РНК (пг). 2. Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) ПЦР – многократное увеличение числа копий специфического участка ДНК, протекающее при циклической смене температур и катализируемое ферментом ДНК- полимеразой 3. Детектирование продуктов ПЦР • гель-электрофорез с флуоресцентным детектированием • метод «конечной точки» с флуоресцентным детектированием • в «реальном времени» с флуоресцентным детектированием Области применения: Генетические исследования ДНК и РНК микроорганизмов, растений, животных, человека, анализ генетически-модифицированных объектов (ГМО), криминалистика, диагностика инфекционных заболеваний 7

Полимеразно-цепная реакция (ПЦР) – многократное увеличение числа копий специфического участка ДНК, протекающее при циклической смене температур и катализируемое ферментом ДНК- полимеразой 8 Денатурация ДНК (90 -950 С) Т, 0 С Отжиг праймеров (55650 С) Элонгация (60720 С) праймеры ДНКполимераза д. АТФ д. ТТФ д. ЦТФ д. ГТФ Время, с ТЕРМОЦИКЛ д. НТФ ампликоны Продукты ПЦР (ампликоны) - копии специфического участка ДНК, синтезируемые в результате реакции

Полимеразная цепная реакция Динамическая кривая ПЦР-РВ 9 Градуировочная зависимость E = (10 -1/tg(α)-1)· 100% Зависимость количества ДНК (N) от числа проведенных термоциклов (n) N=N 0(1+E)n, где E – эффективность амплификации, N 0 начальное содержание ДНК. Температурно-временной режим ПЦР

Выбор материала и изготовление микрочипов 10 Материалы для изготовления микрочипов Требования к материалу: q высокий коэффициент теплопроводности q прозрачность материала покровной пластины q устойчивость к повышенной температуре и растворителям q возможность легко модифицировать поверхность q технологичность изготовления и доступность производственной базы Микрофлюидные чипы: КРЕМНИЙ СТЕКЛО Микрореакторные чипы: КРЕМНИЙ АЛЮМИНИЙ

Выбор материала и изготовление микрочипов 11 Методы изготовления микрочипов УФ УФ Нанесение рисунка микроструктур на кремниевую пластину – контактная фотолитография Химическое травление микроструктур и отверстий ввода/вывода растворов в кремнии Спекание пластины кремния и покровного стекла P (160 тонн) Штамповка Al пластины Si – Si. O 2 Si Al 9 реакторов 48 реакторов 30 реакторов

Выбор материала и изготовление микрочипов 12 Характеристики разработанных микрочипов Функциональность микрочипа Ферментативная реакция Жидкостная экстракция в потоке ПЦР-РВ в микрофлюидном канале ПЦР-РВ в микрофлюидных реакторах ПЦР-РВ в открытых микрореакторах Схема микрочипа Топология Материал Матрица 3 х3 Н-канал Кремнийстекло 40 × 60 1000 × 140 Кремнийстекло 40 × 60 200 × 140 Y-канал Стекло 30 × 70 100 × 30 22 × 40 200 × 140 25 × 28 2000 × 400 1800 × 300 1600 × 300 25 × 28 1800 × 400 Матрица 3× 3 Кремнийстекло Матрицы Кремний 4× 4, 4× 5, 5× 6, 6× 8 Матрицы Алюминий 4× 6, 5× 6 Габаритные Размеры размеры, мм микроструктур (Ш х Г), мкм

Общая схема микрочиповой аналитической системы 13 Светодиод с 4 рабочими кристаллами ПЗС матрица Возбуждение, нм 480÷ 495 510÷ 530 FAM, флуоресцеин 540÷ 560 1 - микрочип; 2 - картридж, 3 - слой изолирующей жидкости, 4 - система термоциклирования, 5 - светодиод, 6, 8 - светофильтры; 7 - дихроичное зеркало; 9 - цифровая ПЗС-камера; 10 - система управления Флуоресценция, нм Красители 580÷ 640 ROX, Родамин Предел обнаружения: Канал 1 – 1, 4· 10 -9 M Канал 2 – 3, 9· 10 -9 M

Разработка макета ПЦР-РВ амплификатора Микрочиповый ПЦР-РВ анализатор «Aria. DNA» Изготовитель: «Люмэкс» Прибор: «Aria. DNA» Нагрев 10 °С/с Охлаждение 10 °С/с Объем 1, 0 – 3, 6 мкл Кол-во реакций: от 16 до 48 Детектирование: 2 канала Si Al 48 реакторов 30 реакторов Микрочипы 14

Модификация поверхности микрочипов 15 Требования к модифицированной поверхности: q устранять влияние материалов микрочипа на эффективность ПЦР q технологичность изготовления, доступность производственной базы, воспроизводимость свойств Микрофлюидные и микрореакторные чипы q модификация в условиях микрофлюидных каналов q возобновляемость, многократная отмывка-нанесение Микрофлюидные чипы q гидрофильность q защита от взаимодействия компонентов ПЦР с материалом чипа Микрореакторные чипы

Модификация поверхности микрочипов гидрофоб/гидрофоб А) (CH 3)2 Si. Cl 2 16 гидрофил/гидрофил Б) Si. O 2

430 мкм Модификация поверхности микрочипов 150 мкм 1, 5 мм Гидрофильно-гидрофобная поверхность Si или Al Ø Слой ПММС, 10 мкм Ø Молекулярные слои модификатора, ~100 нм Ø Слой оксида кремния, Si. O 2 , 80 – 120 нм гидрофобный слой ПММС гидрофильный слой молекулярных модификаторов слой Si. O 2 Si / Al основа 17 гидрофоб/гидрофил слой ПММС вне микрореактора, слой Si. O 2 и слой модификатора внутри микрореактора

Модификация поверхности микрочипов Гидрофильность поверхности Предотвращение ингибирования ПЦР Кремниевый микрочип Электронейтральность поверхности Алюминиевый микрочип 1) Создание слоя оксида кремния 2) Модификация аналогично кремниевому микрочипу 1) Создание слоя оксида алюминия 2) Обработка поливиниловым спиртом 18

Модификация поверхности микрочипов 19 Модификация поверхности Si и Al Плазмохимический синтез покрытий на микрочипов в плазме ВЧ-разряда поверхности Si и Al 10 мин, Ar + O 2/гидрофил 10 мин, Ar + Oct. OH/гидрофоб 20 мин, Ar + Oct. OH/гидрофоб 10 с, О 2 / гидрофил Ø Оптимизация состава органических плазмо-полимеризованных слоёв: Ø ацетилен (г), октанол, гептан, гексаметилдисилоксан (ГМДС) (ж) Ø Оптимизация структуры покрытий: многослойные покрытия Ø Оценка защитных свойств получаемых покрытий электроимпедансная спектроскопия EIS, EDX, видеоскопия, прочность адгезии Ø Повышение стабильности качества при производстве

20 Модификация поверхности микрочипов № образца 1 2 3 4 5 6 7 8 Вещество, формула Гептан, С 7 H 16 стадия 1 стадия 2 Толуол, C 7 H 8 Triton X-100, C 14 H 22 O(C 2 H 4 O)n n = 9– 10 Октанол-1, С 8 H 17 OH Изопропанол, C 3 H 7 OH стадия 1 ГМДС, ((CH 3)3 O)2 Si стадия 2 Контрольный образец А Контрольный стадия 1 образец Б стадия 2 Расход. O 2, Ar, см 3/мин см t, мин P, mbar 15 0, 29 5 4 120 30 15 0, 29 0, 19 5 5 4 4 20 20 60 0, 17 5 4 40 60 0, 39 10 4 20 5 4 40 30 W, Вт 10 10 0, 17 5 5 4 4 20 80 – – – 5 30 0, 38 0, 44 5 – – 10 200

21 Модификация поверхности микрочипов Схемы модификации поверхности микрочипов: Методы модификации Фаза Гидрофил - гидрофоб свойства Si-Si. O 2 МФЧ Si МРЧ Al МРЧ Технол огично ть Защит ные свойтв а Воспро изв. свойст в покры тий Хлоралкилсиланы Ж Гидрофоб. + - - - NA + Полиалкилсилоксаны Ж Гидрофоб. + - - - NA + Алкоксисиланы+ Эпоксиэфиры Ж Слабо. Гидро фил. - + - - NA + Хлорсилан + Алкоксисиланы+ Эпоксиэфиры Г Ж Слабо. Гидро фил. - - + - Кислоты Ж Гидрофил - + + + - + Щелочь Ж Гидрофил - + + + - + Хлорсилан Г Гидрофил - + + - Плазмохимический синтез ГМДС Г Гидрофил - + + + Плазмохимический синтез ГМДС + С 2 Н 2 Г Гидрофил - + + - Плазмохимический синтез ГМДС + С 7 Н 18 Г Гидрофил - + + -

Лиофилизация реактивов в микрочипе • Трудоемкость и длительность стадии приготовления растворов • Хранение и транспортировка при низких температурах • Иммобилизация всех компонентов ПЦР-раствора • Стабилизация активности ДНК-полимеразы Количество операций 30 -70% меньше Стандартный режим амплификации Ускоренный режим амплификации Стабилизатор Сахароза Манит Трегалоза Сорбит Тип высушивани я Возд Лиоф Относительный пороговый цикл ( %) при хранении при 50°C 0 ч 24 ч 170 ч 100± 4 0 0 100± 3 0 0 101± 3 94± 3 92± 5 104± 8 93± 5 93± 3 101± 3 97± 4 96± 3 100± 3 98± 3 101± 3 96± 8 89± 3 105± 6 95± 3 96± 3 Стабилизатор Относительный пороговый цикл, % 100 m. M Трегалоза 65± 4 100 m. M Трегалоза 1% Tween 20 81± 3 100 m. M Трегалоза 2% поливиниллпирролидон 89± 3 100 m. M Трегалоза 1% Tween 2% поливиниллпирролидон 97± 4 Контроль 99± 2

Качественный анализ ГМО Предел обнаружения СО 18 S 35 S 1% ГМО + + + + - 0, 5% ГМО 0, 1% ГМО 0% ГМО Оценка специфичности определения Результат ГМО Образец ГМО-соя + (+) - (-) + (+) ГМО Корм для рыб Соевая мука + (+) - (-) + (+) Нет ГМО Количественный анализ ГМО 35 S Генетический маркер NPTII t. NOS 18 S Время выполнения ПЦР составило 23 мин Содержание ГМО в образце 0, 75 ± 0, 07%, Найденное содержание – 0, 64 ± 0, 13% Предел обнаружения ГМО составил 0, 05%, что соответствует требованиям нормативных документов. 2 3

Инфекции передаваемые половым путем (ИППП) Простейшие TV Trichomonas Vaginalis Грибы CA Candida Albicans MG Mycoplasma genitalium MH Mycoplasma hominis CT Chlamydia trachomatis UR Ureaplasma spp. NG Neisseria gonorrhoeae HSV Herpes simplex virus 1/2 типа 24 Бактерии Вирусы Возбудители ИППП и наиболее частые клинические синдромы

Инфекции передаваемые половым путем (ИППП) Кол-во образцов ~750 Si микрочипы (30 м/р) с лиофилизированными ТС ДС -- Диагн. специфичность = ИО / (ИО+ЛП) ДЧ -- Диагн. чувствительность = ИП / (ИП+ЛО) АЧ – Аналитич. чувствительность = 1000 копий ДНК/мл 25 ИО -- Истинно отрицательные ЛП -- Ложно положительные ЛО -- Ложно отрицательные ИП -- Истинно положительные

Генетика: определение мутаций в геноме человека Изучение частоты встречаемости полиморфизма генов гемостаза (F 2, F 5) и фолатного цикла (MTHFR) на примере донорской ДНК (n=100) Ген, название Полиморфизм Частота встречаемости полиморфизма F 2 20210 G>A гетерозигота: 4% F 5 1691 G>A гетерозигота: 3% MTHFR 677 C>Т гетерозигота: 54%, гомозигота: 5% 1298 A>C гетерозигота: 43%, гомозигота: 12% MTHFR 677 CT + MTHFR 1298 AC смешанный: 9% F 2, F 5, MTHFR F 5 1691 GA + MTHFR 677 CC + MTHFR смешанный: 1. 5% 1298 AC F 2 20210 GA + MTHFR 677 CT F 5 1691 G/A + MTHFR 1298 AC Результаты ПЦР-РВ, полученные с помощью макета микрочиповой аналитической системы с использованием Si микрочипов, содержащих лиофилизированные реактивы. Кол-во проанализированных образцов донорской ДНК (n=100) 26

Сравнение методов осуществления молекулярно-генетического анализа Пластиковые пробирки твердотельный блок аэроциклирование п/пропилен 60 Объем реакционного сосуда, мкл Кол-во реакторов, шт. Капилляры Микрочиповые системы Микрофлю идные Микрореакторные Разработанн ые системы стекло ПДМС нерж. сталь/п олимер Si, Al 45 30 90 140 18 25 – 50 10 – 20 6 х10 -3 3 x 10 -2 1– 3 96 96 32 9216 3072 16 – 48 0, 1 – 0, 2 100 30 0, 3 – 1 Лиофилизация всех ПЦР реагентов + + – – – + Стоимость реактивов и расходных материалов, отн. ед. + + ++ +++ + Материал Время ПЦР (40 циклов), мин Минимальная концентрация ДНК/РНК, копий/мкл

Выводы: 28 Разработаны оригинальные микрочиповые системы молекулярно-генетического анализа для определения нуклеиновых кислот методом полимеразно-цепной реакции с регистрацией флуоресцентного сигнала в реальном времени. Достигнута теоретически максимально возможная чувствительность ПЦР анализа: минимальное детектируемое содержание нуклеиновых кислот в микрореакторе составляет 1 копию ДНК. Линейный динамический диапазон определяемых содержаний 1 – 105 копий ДНК в микрореакторе, минимальная величина относительного стандартного отклонения порогового цикла 0. 1. Разработаны схемы микрочипов, содержащих от 16 до 96 микрореакторов для одновременного проведения мультиплексной ПЦР-РВ и способы модификации поверхности микрореакторов из кремния и алюминия неорганическими и органическими покрытиями, обеспечивающими минимизацию сорбции компонентов ПЦР смеси. Обоснованы преимущества алюминия как материала для изготовления микрочипов при их массовом производстве. Обоснован выбор условий для серийного изготовления одноразовых микрочипов с модифицирующими покрытиями поверхности, обладающими гидрофильными и гидрофобными свойствами, что обеспечивает экспрессный ввод проб и простую герметизацию микрочипа.

Выводы: 29 На основании сравнительного анализа характеристик систем термоциклирования проведен выбор оптимального принципа нагрева для построения микрочипового анализатора, обладающего в совокупности быстродействием, производительностью, экономичностью и надежностью. Получены скорости нагрева и охлаждения 10 -12 °С/с, при неоднородности теплового поля 0. 1 °С. На основании оптимизации аналитических характеристик мультиплексной аналитической системы ПЦР-РВ достигнуты: высокое быстродействие (20 минут на 45 циклов) и производительность системы (288 ДНК-определений в час). Показано, что оптимальным диапазоном длин ампликонов для достижения максимального быстродействия при сохранении специфичности анализа является длина 80 -150 п. о. , что было продемонстрировано на примере исследованных ПЦР тест-систем. Оптимизирован состав лиофилизированных в микрореакторах ПЦР тест-систем под широкий круг задач молекулярно-генетического анализа. Разработана схема изготовления микрочипов с лиофилизированными реактивами, обладающих сроком хранения не менее 6 месяцев.

Выводы: 30 Оптимизированы условия мультиплексного определения нуклеиновых кислот в реальных объектах с использованием разработанного макета микрочипового ПЦР анализатора. Разработаны методики определения генетически-модифицированных организмов, возбудителей инфекций, передающихся половым путем, полиморфизмов в геноме человека. Достигнуты пределы обнаружения 10000 копий искомой ДНК в исходных образцах объемом 1 мл. Результаты выполненных исследований внедрены при разработке микрочипового амплификатора нуклеиновых кислот «Ариа. ДНА» , выпускаемого ООО «Люмэкс» , г. Санкт-Петербург