МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ Лекция 4 МЕДИЦИНСКАЯ БАКТЕРИОЛОГИЯ: Возбудители кишечных инфекций бактериальной этиологии - ч1
МЕДИЦИНСКАЯ БАКТЕРИОЛОГИЯ Кишечные инфекции бактериальной этиологии Кишечные инфекции, т. е. инфекционные заболевания с фекальнооральным механизмом передачи возбудителя, возникают часто и имеют существенное значение в качестве причины смерти, как у детей, так и у взрослых. Практически единственным путем инфицирования является энтеральный, при котором возбудители поступают с водой или пищей. Естественно, что в связи с этим существенное значение приобретает защитный барьер желудок, содержимое которого, прежде всего соляная кислота, уничтожает при достаточной ее концентрации значительную часть микроорганизмов, попавших в этот орган. Возникающий воспалительный процесс в кишечнике чаще носит очаговый характер. Локализация патологического процесса и особенности возникающих структурных изменений в большей степени связаны с характером возбудителя болезней. Возбудителями этих инфекций могут быть различные бактерии, наиболее важное значение среди них занимают бактерии из семейства Enterobacteriaceae (сальмонеллы, шигеллы, эшерихии, иерсинии, а также клебсиелы).
МЕДИЦИНСКАЯ БАКТЕРИОЛОГИЯ Кишечные инфекции бактериальной этиологии Инфекции, вызываемые Escherichia coli Род Escherichia включает большое количество микроорганизмов, обладающих рядом общих свойств, но отличающихся по биохимическим, антигенным и патогенным свойствам. В состав вида Escherichia coli наряду с непатогенными (банальными) кишечными палочками входят патогенные варианты: ЭГКП (энтерогеморрагические кишечные палочки) возбудители энтерогеморрагического эшерихиоза с гемолитико уремическим синдромом, ЭИКП (энтероинвазивные), вызывающие дизентериеподобные заболевания, ЭТКП (энтеротоксигенные), вызывающие холероподобный эшерихиоз — так называемую диарею путешественников, ЭПКП (энтеропатогенные) — возбудители детских энтеритов и другие возбудители кишечных инфекций, а также уропатогенные эшерихии — возбудители инфекций мочевых путей. Другие эшерихии, являясь условно патогенными, могут вызывать оппортунистические инфекции: пневмонии, нагноения ран и полостей, менингиты, сепсис. Помимо Escherichia coli, такими свойствами могут обладать другие представители рода: Escherichia hermanii, Escherichia vulneris. При накоплении в пищевых продуктах эшерихии могут стать причиной пищевого отравления.
МЕДИЦИНСКАЯ БАКТЕРИОЛОГИЯ Кишечные инфекции бактериальной этиологии Ввиду сходства морфологических и тинкториальных свойств патогенных и условно патогенных эшерихий с другими энтеробактериями микроскопический метод неинформативен и в диагностике практически не используется. В основе диагностики заболеваний, вызванных эшерихиями, лежит выделение возбудителя и определение его принадлежности к той или иной патогенной группе (на основании антигенной структуры и выявления факторов патогенности и/или патогенных свойств — токсинов, адгезинов, инвазинов, а также их генетических детерминант).
МЕДИЦИНСКАЯ БАКТЕРИОЛОГИЯ Кишечные инфекции бактериальной этиологии Питательные среды для бактериологического исследование на кишечные бактериальные инфекции. Агар Эндо — слабоселективная дифференциальнодиагностическая среда для выделения энтеробактерий. Среда Эндо относится к плотным средам для выделения чистых культур. Готовая среда прозрачна и имеет бледнорозовый цвет. Основным реактивом, важным для дифференциации, является основной фуксин, который обесцвечивается в среде при добавлении сульфита натрия (Na 2 SO 3). Кроме того, присутствие в среде этих реагентов оказывает ингибирующее действие на грамположительную микрофлору. Бактерии, способные ферментировать лактозу, изменяют р. Н среды в кислую сторону вследствие образования конечного продукта расщепления — ацетилальдегида. Последний, реагируя с сульфитом натрия, способствует появлению красного окрашивания. Поэтому лактозоположительные бактерии вырастают в виде ярко-розовых и красных колоний, часто с металлическим зеленоватым блеском. Колонии бактерий, не сбраживающих лактозу, бесцветны или
МЕДИЦИНСКАЯ БАКТЕРИОЛОГИЯ Кишечные инфекции бактериальной этиологии Агар Плоскирева — селективная среда для выделения шигелл и сальмонелл. Готовая среда прозрачна, имеет розовато желтоватый цвет. В состав среды Плоскирева входят ингибирующие вещества (желчные соли, бриллиантовый зеленый, йод), вследствие чего она должна полностью подавлять рост грамположительной флоры, значительно задерживать (первые 24 ч) рост эшерихий и другой сопутствующей микрофлоры, подавлять роение протея. Дифференцирующие свойства агара Плоскирева основаны на изменении р. Н в кислую сторону при росте лактозоферментирующих бактерий, которые образуют колонии брусничного цвета (индикатор нейтральный красный). Лактозоотрицательные бактерии вырастают в виде бесцветных или слабоокрашенных колоний. Агар Мак. Конки слабо селективная и дифференциальная среда. Агар Мак. Конки используется для получения и дифференциации лактозо ферментирующих и лактозонеферментирующих граммотрицательных кишечных бактерий. Лактозоферментирующие организмы становятся от розового до кирпично красного цвета с или без зоны преципитации желчи. Лактозо неферментирующие организмы становятся бесцветными.
МЕДИЦИНСКАЯ БАКТЕРИОЛОГИЯ Кишечные инфекции бактериальной этиологии Трехсахарный агар с мочевиной (среда Олькеницкого) – содержит мочевину, аммоний железосульфат, феноловый красный + сахарозу, лактозу, глюкозу, Агар Клиглера – то же + лактозу и глюкозу. Разливают в пробирки и скашивают, оставляя столбик агара. Цвет – красно-бурый. В средах имеется 2 индикаторные системы – первая реагирует на образование аммиака и расщепление сахаров, а вторая обнаруживает сероводород. При расщеплении сахаров среда подкисляется и окрашивается в желтый цвет, при этом в скошенной части агара глюкоза утилизируется в первые часы роста бактерий, ферментирующий этот сахар. Через 18 24 ч бактерии используют пептоны, в скошенной части среды образуется аммиак, среда подщелачивается и приобретает красный цвет, а в столбике, где к этому времени произошло разложение глюкозы в анаэробных условиях, желтый цвет сохраняется (желтый столбик и красный скос). Если бактерии сбраживают еще и лактозу, среда подкисляется и становится полностью желтой. При положительной реакции на сероводород среда чернеет в виде кольца в средней части пробирки.
МЕДИЦИНСКАЯ БАКТЕРИОЛОГИЯ Кишечные инфекции бактериальной этиологии Бактериологическое исследование. Материалом для исследования служат фекалии, которые берут у больного трижды в первые сутки от начала болезни с интервалом 3— 4 ч, а также рвотные массы, промывные воды желудка и кишечника, кровь (при сепсисе), гной (при гнойно воспалительных процессах), отделяемое слизистой оболочки зева, носа, моча, мокрота (при пневмонии); от трупов — содержимое кишечника, кровь, кусочки селезенки, легких и других органов. При подозрении на пищевую токсикоинфекцию исследуют также остатки пищи, смывы с посуды и рук обслуживающего персонала, медикаменты, применяемые per os. Для выделения эшерихий используют среды Эндо и Плоскирева, а для выделения Escherichia coli (ЭГКП, продуцирующих веротоксин — шигаподобный цитотоксин) — среду Мак Конки с сорбитом. Посевы лучше делать у постели больного. Через 18 — 24 ч инкубации при 37 °С изучают характер колоний на плотных средах
МЕДИЦИНСКАЯ БАКТЕРИОЛОГИЯ Кишечные инфекции бактериальной этиологии Колонии имеют красный с металлическим оттенком цвет вследствие расщепления лактозы Эшерихии «патогенных сероваров» по культуральным свойствам и способности ферментировать лактозу не отличаются от банальных эшерихий, обитающих в кишечнике человека (за исключением лактозоотрицательных ЭИКП). Поэтому принадлежность выделенных микроорганизмов к патогенным группам вначале устанавливают по антигенной структуре. При этом отмечают на среде любые 10 лактозоположительных колоний и агглютинируют их на стекле смесью сывороток «патогенных серогрупп» . Смесь готовят таким образом, чтобы конечное разведение каждой сыворотки составляло 1: 10. Отрицательная реакция свидетельствует об отсутствии патогенных Е. coli.
МЕДИЦИНСКАЯ БАКТЕРИОЛОГИЯ Кишечные инфекции бактериальной этиологии При росте на среде Мак. Конки с сорбитом ЭГКП образуют бесцветные колонии в отличие от других эшерихий, которые ферментируют этот углевод и образуют красные колонии. Подозрительные колонии (при положительном результате реакции оставшуюся часть колонии) пересевают на комбинированную скошенную полиуглеводную среду (Рассела, Клигера и т. п. ). На 3 й день учитывают изменения на комбинированном агаре. Ферментацию глюкозы с образованием кислоты или кислоты и газа выявляют по изменению цвета столбика агара (пожелтение среды, нарушение ее целостности), ферментацию лактозы (и сахарозы) — по пожелтению скошенной части среды. При отсутствии ферментации углеводов среда может защелачиваться (за счет выделения аминов при разложении белка) и приобретать красный цвет.
МЕДИЦИНСКАЯ БАКТЕРИОЛОГИЯ Кишечные инфекции бактериальной этиологии
МЕДИЦИНСКАЯ БАКТЕРИОЛОГИЯ Кишечные инфекции бактериальной этиологии На 4 й день исследования проверяют чистоту культуры, определяют ее основные физиолого биохимические свойства (засевают культуру на среды Гисса и другие дифференциальные среды); проводят серотипирование выделенной культуры путем постановки ориентировочной РА на стекле с поливалентной (ОК сывороткой, а затем — развернутой РА с адсорбированными групповыми сыворотками для определения ОК серогруппы. Учитывают дифференциальные биохимические признаки эшерихий: Способность ферментировать лактозу, маннит, рамнозу и ксилозу с выделением кислоты и глюкозу с выделением кислоты и (или) газа, образовывать индол. Отсутствие способности образовывать сероводород, разлагать мочевину, фенилаланин, аргинин, цитрат, ацетоин. Для типирования по К антигену в один ряд пробирок с разведениями диагностической (ОК сыворотки вносят суспензию живой (негретой) культуры, а для определения О антигена в другой ряд пробирок вносят гретую (кипяченную в течение 1 — 2 ч) взвесь бактерий.
МЕДИЦИНСКАЯ БАКТЕРИОЛОГИЯ Кишечные инфекции бактериальной этиологии Кипячение или автоклавирование разрушает поверхностно расположенный К антиген, который мешает определению О антигена. Через сутки инкубирования при 37 °С гомологичные сыворотке штаммы агглютинируются до титра или до половины титра. Культуру, давшую развернутую реакцию с одной из сывороток, сеют на остальные дифференциальные среды для окончательной идентификации. Большую диагностическую ценность имеет обнаружение у выделенных культур (или непосредственно в патологическом материале) факторов патогенности: адгезинов, энтеротоксинов, цитотоксинов и др. Для этого иногда применяют методы иммуно и генодиагностики (РА, ИФА, РП в геле, ДНК зонды, ПЦР), а также экспериментальные модели (заражение культур ткани, лабораторных животных). Адгезивность и инвазивность определяют на культурах тканей Нер-2 или He. La
МЕДИЦИНСКАЯ БАКТЕРИОЛОГИЯ Кишечные инфекции бактериальной этиологии Для этого бульонную культуру бактерий в логарифмической фазе суспензируют в культуральной среде и в строго определенном количестве вносят в емкости с монослоем эукариотических клеток. Через 3 ч инкубирования при 37 °С в присутствии СО 2 клетки ткани отмывают фосфатным буфером, фиксируют и окрашивают (для определения индекса адгезивности) или покрывают свежей культуральной средой, содержащей гентамицин (для уничтожения внеклеточно расположенных бактерий), и продолжают инкубировать в течение 1 ч, после чего многократно промывают монослой, фиксируют и окрашивают его клетки (для определения индекса инвазивности). Индексы вычисляют как среднее количество микробных клеток, взаимодействующих с одной эукариотической (при этом изучают не менее 100 эукариотических клеток в препарате). Поскольку многие гены патогенности эшерихий находятся в составе плазмид вирулентности, для обнаружения патогенных эшерихий применяют ДНК зонды, приготовленные из рестрикционных фрагментов таких плазмид.
МЕДИЦИНСКАЯ БАКТЕРИОЛОГИЯ Кишечные инфекции бактериальной этиологии Колонии эшерихий выращивают на поверхности нитроцеллюлозных фильтров, наложенных на поверхность питательного агара, лизируют их и с помощью ДНК зондов определяют в лизатах нуклеотидные последовательности, кодирующие у патогенных эшерихий синтез факторов адгезии, инвазии и/или соответствующих токсинов. Для ускоренной идентификации возбудителя в исследуемом материале применяют прямую или непрямую РИФ. В этом случае предварительный результат получают через 1 — 2 ч. Для быстрого отбора подозрительных колоний (например, Escherichia coli на агаре с сорбитом), кроме агглютинирующих сывороток, используют латексные диагностикумы, покрытые соответствующими антителами (реакция латексной агглютинации). Для выявления источника инфекции и путей заражения у выделенного штамма определяют фаговар и колициногеновар.
МЕДИЦИНСКАЯ БАКТЕРИОЛОГИЯ Кишечные инфекции бактериальной этиологии Серологическое исследование. Серодиагностика является вспомогательным методом и направлена на обнаружение (например, в ИФА) антител разных классов к эшерихиям и их динамики: смена специфических антител класса Ig. M на Ig. G свидетельствует об остром инфекционном процессе, тогда как наличие в сыворотках антител только класса Ig. G характерно для бактерионосительства. Уточнить диагноз эшерихиоза помогает также обнаружение антител. Результаты исследования сывороток имеют значение в основном для эпидемиологического анализа. Таким образом, диагностику эшерихиозов проводят преиму щественно путем выделения возбудителя, его идентификации и дифференциации с непатогенными эшерихиями (по антигенным и патогенным свойствам).
МЕДИЦИНСКАЯ БАКТЕРИОЛОГИЯ Кишечные инфекции бактериальной этиологии МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПРИ КОЛИ ЭНТЕРИТАХ И ДИЗЕНТЕРИЕПОДОБНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ Испражнения 1 этап 2 этап Характер и цвет колоний Мазок по Граму Посев на среду Эндо Ответ 3 этап Реакция агглютинации на стекле с материалом из отдельных колоний и смесями ОВ сывороток Ответ Пересев агглютинабельных колоний на скошенный питательный агар (чистая культура) Реакция агглютинации на стекле со смесями ОВ сывороток Развернутая реакция агглютинации Реакция агглютинации с типоспецифическими сыворотками Посев на «пестрый ряд» Окончательный ответ
Скачать презентацию МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ Лекция 4 МЕДИЦИНСКАЯ
Лекция 4_возбудители кишечных инфекций-ч1.ppt