Микробиология дифтерии и коклюша Лекция для курсантов ПДО

Микробиология дифтерии и коклюша Лекция для курсантов ПДО Ом. ГМА

Микробиология дифтерии

v Классификация коринебактерий u Отдел «Грамположительные» бактерии u Подотдел 4: Бактерии с высоким % содержания G+C u Порядок Actinomycetales u Подпорядок Corynebacterineae Ø Семейство Corynebacteriaceae (коринеформные бактерии) Ø Род Corynebacterium

v Род Corynebacterium u- Corynebacterium diphtheriae и большая группа близких по морфологическим и биохимическим свойствам МО рода Corynebacterium называют коринеформными бактериями или дифтероидами (Гр+палочки, неподвижные с утолщениями на концах) u Составляют 3 экологические группы (патогены Ч и Ж,

v Коринебактерии - возбудители дифтерии u u Дифтерия является острой инфекцией верхних отделов дыхательных путей, преимущественно детского возраста, вызываемой токсинпродуцирующими штаммами Corynebacterium diphtheriae. Значительно реже аналогичное по клинической симптоматике заболевание могут вызывать токсигенные штаммы Corynebacterium ulcerans

v Коринебактерии - возбудители дифтерии § Эпидемиология. Резервуар – больной человек, реконвалесцент, § Пути передачи: u бактерионоситель. - воздушно-капельный (основной) Контактно-бытовой § Сезонность – § Устойчивость во внешней среде – - осенне-зимняя. хорошо сохраняется при низких температурах, в высушенном состоянии (в слюне, слизи, в пыли)

v Коринебактерии - возбудители дифтерии u Дифтерия • • – характеризуется: интоксикацией организма дифтерийным токсином фибринозным дифтиридическим воспалением в месте локализации возбудителя (phther – плёнка)

Дифтерия зева

v Морфология и тинкториальные свойства Corynebacterium diphtheriae Тонкие полиморфные палочки с булавовидными концами, часто с валютиновыми включениями. Имеют микрокапсулу, фимбрии. u Тинкториальные свойства Гр+палочки. Окраска мазков: - по Граму - по Нейссеру ( хризоидином или везувином) - по Лёффлеру (метиленовым синим) u

v Культуральные свойства Corynebacterium diphtheriae u u На простых средах не растут Высоко требовательны к питательным средам с обязательным наличием крови или сыворотки крови. Растут при 37 0 С, в течение 24 -48 часов Corynebacterium diphtheriae mitis обладает способностью вызывать гемолиз эритроцитов Среды для культивирования: - Кровяно-теллуритовый агар – КТА, Коринебакагар – КБА, Маклеода (теллурит-шоколадный агар) Лёффлера, Ру, 5% КА.

v Рост Corynebacterium diphtheriae на среде КТА * Теллурит калия подавляет рост сопутствующей микрфлоры. При восстановлении его коринебактериями коноии окрашиваются в тёмно-серый или чёрный цвет

Рост Corynebacterium diphtheriae на среде КТА

v Биотипы Corynebacterium diphtheriae: gravis, mitis, intermedius u Биотипы отличаются по морфологии, Аг и б/х свойствам, тяжести заболеваний у человека. Ø Corynebacterium diphtheriae gravis – вызывает более тяжёлое течение заболеваний. На КТ средах растёт в виде колоний R-формы – крупные с неровными краями и радиальной исчерченностью ( «маргаритка» ). Corynebacterium diphtheriae mitis – вызывае преимущественно спорадические лёгкие заболевания. На КТ средах растут в S-форме в виде мелких гладких колоний с ровными краями. Corynebacterium diphtheriae intermedius – средней тяжести заболевания. Рост на средах в Ø Ø

v Биохимические свойства Corynebacterium diphtheriae u u Ферментируют глюкозу (+), мальтозу (+). Не ферментируют сахарозу (-). Не образуют уреазу (проба Заксе на мочевину – отрицательная). Обладают цистиназной активностью (Расщепляют цистин на среде Пизу)

v Биохимические свойства Corynebacterium diphtheriae и других коринебактерий Вид коринебактерий Токси- Ферментация (разложение) Редукгенция Цисти Глюко- Сахаро Крах Моче нитраные на зы зы мала вины свойства тов +/- + + - + C. diphtheriae mitis +/- + + - - - +/- C. ulcerans +/- + + - C. pseudotubercu losis (C. ovis) +/- + + - - + +/- C. pseudodophthericum - - - + + C. xerosis - - + + - - + C. diphtheriae gravis

v Факторы патогенности Corynebacterium diphtheriae u Токсигенные штаммы Corynebacterium diphtheriae продуцируют сильный экзотоксин – термобильный, высокотоксичный иммуногенный белок. u Потенциально токсигенными являются C. ulcerans и C. pseudotuberculosis. Токсин вызывает необратимое блокирование удлинения полипептидной цепи, т. е. любого белкового синтеза. Поражаются определённые системы (симпатико-адреналиновая, сердце, кровеносные сосуды, периферические нервы. Отмечаются структурные и функциональные нарушения миокарда, демиелинизация нервных волокон, приводящая к параличам и парезам).

v Факторы патогенности Corynebacterium diphtheriae Дифтерийный токсин – результат u лизогении b-фагом или другими коринефагами, которые содержат структурный ген (tox-ген) молекулы токсина u низкой внеклеточной концентрации железа. Т. е. способность к токсинообразованию проявляют лишь лизогенные штаммы, инфицированные бактериофагом (bфагом), несущим ген tox, который

v Антигенная структура Corynebacterium diphtheriae u Имеют: - межродовой О – Аг (Полисахаридный Аг клеточной стенки). Обуславливает неспецифические перекрёстные реакции с МО данного семейства (с микобактериями, актиномицетами) - видовой К – Аг (Поверхностные капсульные белки). Обладают видовой и иммуногенной специфичностью. Выделено 11 сероваров, из них 1 -5 и 7 С. gravis.

v Иммунитет и профилактика Иммунитет - стойкий, преимущественно антитоксический. u Для количественного определения уровня антитоксического иммунитета ранее применялась проба Шика. Дифтерийный токсин вводился внутрикожно. u Профилактика – массовая иммунизация населения различными препаратами, содержащими анатоксин – АКДС, АДС-М, АД и АД-М. u

v Лабораторная диагностика возбудителей дифтерийной инфекции u Основной метод диагностики – бактериологический, применяемый для выявления больных, бактерионосителей, контактных. u Материал для исследования: Мазки со слизистой оболочки зева и носа, плёнки с поверхности миндалин и носоглотки. Кровь, сыворотка крови. Секционный материал слизистой оболочки зева и носа, плёнки с поверхности миндалин - u Материал забирается стерильными тампонами вмонтированными в пробирки; баночки; флаконы.

v Методы исследования 1. Бактериоскопические методы для ориентировочного u - заключения: Окраска по Граму, метиленовой синью, Лёффлеру, Нейссеру; Окраска корифосфином (люммикроскопия)

v Окраска по Граму или метиленовым синим u Палочки сине-голубые с тёмно-синими включениями в виде булавовидных утолщений, расположены под углом

v Окраска зёрен валютина по методу Нейссера: 1. На фиксированные мазок нанести ацетат синьки Нейссера на 2 - 3 мин. 2. Добавить раствор Люголя на 10 -30 сек. 3. Промыть водой. 5. Докрасить мазок водным раствором визувина или хризоидина 0, 5 - 1 мин. 6. Промыть, высушить, микроскопировать. Зёрна валютина представляют собой включения полифосфатов, имеющих щелочную реакцию, поэтому избирательно воспринимают ацетат синьки, окрашиваясь в тёмно-синий цвет. * (При использовании красителей хризоидина или везувина зёрна валютина окрашиваются в жёлтокоричневый цвет). Цитоплазма клетки, обладающая кислой реакцией, воспринимает щелочной краситель везувина и окрашивается в жёлтый цвет.

Красители хризоидин и синька Нейссера для окраски зёрен валютина по методу Нейссера:

Окраска зёрен валютина по методу Лёффлера u u На фиксированный мазок наливают на 3 -10 мин раствор метиленового синего по Лёффлеру. Сливают краску Ополаскивают дистиллированной водой. Просушивают, можно аккуратно промакнуть фильтровальной бумагой. Пропись раствора метиленового синего по Лёффлеру: - Насыщенного спиртового раствора метиленового синего – 30 мл - Дистиллированной воды – 100 мл - 1% раствора едкого кали – 1 мл Раствор стойкий. При хранении его красящая способность и свойство давать метахроматическое окрашивание нуклеиновых соединений повышается за счёт образования азуров. u

v Окраска зёрен валютина по методу Нейссера и Лёффлера : u u Зёрна валютина тёмно-синего цвета по методу Лёффлера. При использовании красителей хризоидина или везувина по методу Нейссера, зёрна валютина окрашиваются в жёлто-коричневый цвет. Цитоплазма клетки окрашена в жёлтый цвет Палочки находятся под углом друг к другу Окраска по методу Нейссера Окраска по методу Лёффлера

v Методы исследования u 2. Бактериологический метод. I этап: Первичный посев на элективные среды с теллуритом и 5% КА для накопления коринебактерий и изучения гемолитической активности. II этап: Выделения чистой культуры III этап: 1. Идентификация выделенной чистой культуры (По мазкам, культуральным признакам, по биохимическим признакам). 2. Определение токсигенных свойств (Реакция преципитации в агаре, ИФА). 3. ПЦР с целью обнаружения tox-гена. 4. Определение чувствительности к антибиотикам 5. Фаготипирование для дифференциации штаммов коринебактерий дифтерии

Рост Corynebacterium diphtheriae на КБА

v Методы исследования 3. Серологические и иммунологические методы: Определение дифтерийного токсина с помощью РНГА в чистых и смешанных культурах с эритроцитарным дифтерийным антительным диагностикумом. Определения уровня антитоксина в сыворотке больного РПГА с диагностикумами эритроцитарными дифтерийными антигенными сухими. Определение титра Аt к дифтерийному токсину в сыворотке крови в реакции нейтрализации (РН) на культуре клеток. Агглютинация с противодифтерийной сывороткой C. d. gravis и C. d. mitis. Выявление антибактериальных и антитоксических At различных классов (Yg А, М, G) в ИФА. u 1. 2. 3. 4. 5.

v Серологические методы РПГА « + » РПГА « - »

Серологические методы РПГА в парных сыворотках

v Методы исследования u Экспресс-методы: биохимические и молекулярнобилогические – метод генетических зондов и ПЦР для выявления фрагмента А toxгена. u Биологический метод: определение токсигенности на морских свинках.

v. Тест иммунопреципитации Элека u Штаммы способные вызывать заболевания обладают токсигенными свойствами u Тест наиболее часто используемый микробиологическими лабораториями всего мира фенотипический метод определения токсигенности

Тест иммунопреципитации Элека

v Тест иммунопреципитации Элека (иммунодиффузия) в геле u - фенотипический метод определения токсигенности

v Тест иммунопреципитации Элека (иммунодиффузия) в геле u - - Образование линий ( «усов» преципитации Диски пропитанные антитоксической дифтерийной сывороткой (At) Бляшки испытуемой культуры (Agи )

v Метод двойной радиальной иммунодиффузии. А u u Б А — иммунологически эквивалентные антигены Б — иммунологически различные антигены

v Метод двойной радиальной иммунодиффузии. В Г u В и Г—антигены с частичным

Диагностические препараты

Микробиология коклюша и паракоклюша

Основные регламентирующие и методические НД

u МР МЗ СССР 1984 «Коклюш и паракоклюш»

МР МЗ СССР 1984 «По бактериологическому и серологическому исследованиям при коклюше и паракоклюше» .

СП 3. 1. 2. 1320 -03 «Профилактика коклюшной инфекции» .

МР «Коклюш у привитых детей, клиническая и лабораторная диагностика» С-Петербург. 2003 г.

v Род Bordetella Семейство Halobacteriaceae Клинический синдром коклюша могут вызвать 3 вида бактерий рода Bordetella: - Bordetella pertussis – возбудитель острого инфекционного заболевания коклюша сопровождающегося воспалением гортани, трахеи и бронхов и приступообразным кашлем. - Bordetella parapertussis - возбудитель паракоклюша - Bordetella bronchoseptica - возбудитель коклюшеподобного заболевания собак, кошек и кроликов. У людей может вызывать заболевания по типу ОРВИ

v Морфология и тинкториальные свойства: Грам «-» отрицательные мелкие овоидные палочки - коккобациллы (0, 2 -0, 5 мкм х0, 5 -2, 0 мкм). u Строгие аэробы u B. pertussis и B. parapertussis неподвижные, за исключением B. bronchoseptica (жгутики). У B. pertussis обнаружены пили, принимающие участие в адгезии. u B. pertussis имеют капсулу, у B. parapertussis её нет. u Спор не образуют u Во внешней среде неустойчивы. u

v Культуральные свойства u Высоко требовательны к питательным средам и условиям роста, особенно возбудитель коклюша. Для первичного выделения гемофильных бордетелл используется: - среда Борде-Жангу (картофельноглицериновый агар), - полусинтетические среды –КУА (казеиново-угольный агар), - синтетический – Бордеагар. u

v Культуральные свойства u u u На перечисленных средах бордетеллы вырастают в виде характерных колоний: Температура выращивания 35 -37 0 С. Колонии формируются в разные сроки, более продолжительный срок у B. pertussis (3 сутки): - На среде Борде-Жангу, – выпуклые, гладкие, блестящие, серебрянного цвета, напоминающие капли ртути окружённые зоной гемолиза; - На КУА - выпуклые, гладкие, серого цвета с жемчужным, желтоватым или беловатым оттенком. Колонии маслянистые, легко снимаются петлёй. - B. parapertussis – за счёт образования пигмента вызывает потемнение сред с кровью, образует тёмную подложку. - B. parapertussis и B. вronchoseptica менее прихотливы к питательным средам. - B. pertussis нуждается в сложных питательных средах - B. вronchoseptica способна также расти в фосфатно -солевом буфере и пресной воде.

v. Биохимические свойства u B. pertussis - наименее активна ферментативно – оксидазоположительна. u B. parapertussis – вырабатываезы. т ферменты тирозиназу и уреазу и не образует оксидазу. u B. Bronchoseptica – вырабатывает уреазу, оксидазу, утилизируют цитраты, восстанавливают нитраты в нитриты.

Антигенные свойства Родовые u Видовые – О Аг u Факторы патогенности 1. Экзотоксин термолабильный (тропизм к нервным тканям и сосудистой) 2. Эндотоксин термостабильный (токсическое и сенсибилизирующее действие 3. Трахеальный цитотоксин – повреждение мерцательного эпителия

v Лабораторная диагностика Материал для исследования: - мокрота, - слизь из носоглотки Материал для исследования забирается из носоглотки: - стерильными мягкими тампонами (сухим и увлажнённым) вмонтированными в пробирки, под контролем шпателя, которым прижимается корень языка; - Методом «кашлевых пластинок» после механического раздражения сухим тампоном ребёноку подносят открытую чашку с КУА и держат в течение 6 -8 кашлевых толчков. u

v Методы диагностики u Бактериоскопический метод практически не используется. Чаще используется эспресс-метод – иммунофлюоресцентный.

РСК в парных сыворотках