Механизмы ишемического повреждения головного мозга И М Шетова

Механизмы ишемического повреждения головного мозга И. М. Шетова Кафедра фундаментальной и клинической неврологии РГМУ Зав. кафедрой – чл. корр. РАМН, профессор В. И. Скворцова

Мозговой кровоток CBF = 55 мл / 100 г в минуту

Алгоритм реакций ткани мозга на снижение мозгового кровотока Мозговой кровоток, мл/100 г в мин 80 70 НОРМА 60 50 40 30 20 10 0 Изменение белкового синтеза Селективная экспрессия генов Лактат-ацидоз Цитотоксический отек Энергетический дефицит Глутаматная эксайтотоксичность Аноксическая деполяризация ИНФАРКТ K. A. Hossmann, 1994

Патогенез ишемии мозга 50 АТФ Метаболический ацидоз 40 Ca Глутамата 30 20 10 Кровоток мл/100 г в мин Свободные радикалы NO Воспаление Экспрессия генов Апоптоз

1 -й критический уровень Снижение кровотока до 70% • Торможение белкового синтеза • Рассредоточение рибосом • Селективная экспрессия генов

2 -й критический уровень Снижение кровотока до 50% • Активация анаэробного гликолиза • Лактат-ацидоз • Цитотоксический отек

3 -й критический уровень Снижение кровотока на 70% • Снижение синтеза АТФ • Энергетическая недостаточность • Нарушение каналов ионного транспорта • Дестабилизация мембран • Увеличение выброса аминоцидергических нейротрансмиттеров

Снижение кровотока до 10 -15 мл на 100 г • Аноксическая деполяризация мембран Критерий необратимого повреждения клеток

• Временная окклюзия (< 2 мин) • «Включение» коллатералей Полное восстановление кровотока Постоянная окклюзия Постишемическая гиперемия Высвобождение из ишемизированной ткани провоспалительных метаболитов Снижение кровотока ниже доишемического уровня (no-reflow)

Гемодинамические события, связанные с церебральной ишемией Мозговой кровоток мл/100 г/мин 120 100 ГИПЕРЕМИЯ 80 60 феномен невосстановленного кровотока норма ГИПОПЕРФУЗИЯ 0 ИШЕМИЯ 2 мин 0 длительность ишемии, мин

Формирование инфаркта мозга Ядро инфаркта Область «полутени» Тромб

Повреждение ткани головного мозга на фоне снижения церебрального кровотока Мозговой кровоток, мл/100 г в мин Аноксическая деполяризация мембран, смерть клетки Отдаленные от ишемии области головного мозга 60 Доброкачественная олигемия 50 40 30 “Ишемическая полутень” Лактат-ацидоз, цитотоксический отек Снижение белкового синтеза, селективная экспрессия генов 20 10 “Ядро” 0 Энергетический дефицит, глутаматная эксайтотоксичность, увеличение содержания внутриклеточного Са 2+ (пенумбра) ишемии 3 -5 мин сутки Время от начала ишемии до необратимого повреждения K. A. Hossmann, 1989, 1994

Усиление Экстракции Кислорода из Крови При Острой Локальной Ишемии Мозга Мозговой кровоток (перфузия) Потребление кислорода в ткани Экстракция кислорода из крови

Ранняя МРТ-диагностика церебральной ишемии (4 часа после окклюзии мозговой артерии) МР-ангиография Перфузионный режим Диффузионный режим Появление клинических симптомов Т 2 -взвешенное изображение

МРТ-динамика инфаркта мозга (1) 12 часов 3 -и сутки 7 -е сутки 21 -е сутки 2 месяца 6 месяцев 1 год

Динамика увеличения объема инфаркта головного мозга на фоне острой фокальной церебральной ишемии (по данным МРТ) % 100 80% 75 70% 50 50% 25 0 50 100 150 200 250 300 «терапевтическое окно» 350 400 450 500 длительность ишемии, мин

мозгового кровотока ( СBF) [O 2 ] и [глюкозы] в ткани мозга [ATP], p. H, + [K ] e Деполяризация мембраны нейрона 2+ [ГАМК] [Са 2+] i . 2 . НЕКРОТИЧЕСКАЯ смерть

Глутаматная эксайтотоксичность

Строение NMDA-рецептора

Структура NMDA рецептора

Динамика концентрации глутамата и ГАМК в цереброспинальной жидкости больных с каротидным ишемическим инсультом Глутамат ГАМК мкмоль/л 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Тяжелое N Состояние состояние Состояние средней крайней тяжести 3 -6 ч 12 ч 18 ч мкмоль/л 5 4 3 2 1 0 N Состояние Тяжелое Состояние средней состояние крайней тяжести 24 ч 3 -и сутки

Временная последовательность этапов ишемического каскада From Dirnagl, Iadecola, Moskowitz Trends Neurosci, 1999

Изменения проницаемости ГЭБ Проникновение нейроспецифических белков головного мозга (антигенов) в кровь Аутосенсибилизация мозговыми антигенами Проникновение антител к нейроспецифическим белкам в головной мозг Дегенеративные изменения головного мозга

мозгового кровотока ( СBF) [O 2 ] и [глюкозы] в ткани мозга [ATP], p. H, + [K ] e Деполяризация мембраны нейрона 2+ [ГАМК] [Са 2+] i . 2 . НЕКРОТИЧЕСКАЯ смерть

Временная динамика процессов формирования инфаркта мозга на фоне острой фокальной ишемии Энергетический дефицит 2+ Оксидантный стресс Дисбаланс цитокинов, локальное воспаление, микроциркуляторноклеточные реакции Программированная смерть Ишемия Минуты Дни Часы 3 6 12 24 3 7 Время после ишемии

Роль NOs в патогенезе ишемии индуцирует некроз n-NOs попадание продуктов деградации в межклет. пр-во иммунный ответ: высвобождение цитокинов (tnf-a, i. LB) e-NOs вазодилятация хемотаксис; инфильтрация периинфарктной зоны Активация nf-cappa. В выброс свободных радикалов, свободнорадикальное окисление Активация i-NOs

Этапы изучения наследственных аспектов цереброваскулярных заболеваний I Систематические эпидемиологические исследования (ВОЗ, 1959 г. ) II Генеалогические исследования семейный анамнез лиц, страдающих цереброваскулярной патологией конкордантность у монои дизиготных близнецов III Молекулярно-генетические исследования

Семейная предрасположенность фактор риска инсульта

Наследуются: • Предрасположенность к инсульту и ТИА • Основные факторы риска артериальная гипертония гипертрофия миокарда дислипидемия гипергликемия (Е. Ф. Давиденкова, 1979 M. J. Alberts, 1991 The Framingham Study, 1993)

Финское популяционное исследование (n = 14 371; 1997) Положительный семейный анамнез по заболеваемости инсультом индивидуального риска развития инсульта у мужчин и женщин max 25 - 49 лет Семейный риск Индивидуальный риск

Ишемические инсульты с моногенным типом наследования • Лица молодого и среднего возраста • Без признаков атеросклероза и артериальной гипертензии • Указания на наличие инсультов у молодых родственников

Изучение генетических аспектов мульфакторных инсультов I. Генетика факторов риска развития инсульта II. Изучение индивидуальной чувствительности мозга к ишемии

I. Генетика факторов риска • Гены РААС (АПФ, АТГ) • Гены e-NOS • Гены системы гемостаза (протромбина фактора V) • Гены липидного обмена (аполипопротеина) • Гены обмена гомоцистеина 1998 – 2004 гг.

Структура гена АПФ 17 р 64. 532 К-64. 573 К 16 -й интрон 1749348 287 пар нуклеотидов Инсерция - I Делеция - D Генотипы: I/I D/D I/D Мутация участка ДНК [АПФ], АТ-II деструкции брадикинина

110 семей (славяне, Московская популяция) Атеротромботический ишемический инсульт Хроническая ИБМ (ДЭ) • > 10 лет • без немых кист на МРТ 69 75 41 44 пробандов (68, 4 2, 7) сибсов (71, 2 2, 4) пробанд (68, 4 2, 7) сибса (71, 2 2, 4) из них близнецов: 3 пары монозиготных; 4 дизиготных из них близнецов: 2 пары монозиготных; 3 дизиготных

Распределение полиморфных вариантов гена АПФ у больных с ишемической болезнью мозга и их сибсов *** *** Больные с ишемическим инсультом Сибсы больных с ишемическим инсультом Больные с ДЭ Сибсы больных с ДЭ *** - Достоверность различий между группами, p < 0, 001

Частота встречаемости стенозов МАГ у больных и их сибсов с различными полиморфными вариантами гена АПФ 60% *** 50% Больные со стенозами более 70 % *** доля стенозов 40% 30% Сибсы со стенозами более 70 % 20% 10% 0% D/D I/I *** - Достоверность различий между группами с различным полиморфным вариантом строения гена АПФ, p < 0, 001

Распределение генотипов АПФ в различных возрастных группах и у больных ишемической болезнью мозга 60% 50% *** Дети 40% Молодые люди 30% Средний возраст 20% Пожилые люди Больные с инсультом 10% 0% D/D I/I *** - Достоверность различий между группами, p < 0, 001

Структура гена e. NOS 7 q 36 18 -й интрон 783702 838362 Генотипы: 4 a/4 a 4 b/4 b 4 a/4 b Мутация участка ДНК 4 (4 а) или 5 (4 b) тандемных повторов из 27 пар нуклеотидов

Распределение полиморфных вариантов гена e. NOS у больных с ишемической болезнью мозга и их сибсов 80% *** *** 60% Больные с ишемическим инсультом Сибсы больных с ишемическим инсультом 40% *** *** Больные с ДЭ 20% Сибсы больных с ДЭ 0% 4 a/4 a 4 a/4 b 4 b/4 b *** - Достоверность различий между группами, p < 0, 001

Распределение полиморфных вариантов гена e. NOS у больных и сибсов с сахарным диабетом II типа 80% *** Больные с сахарным диабетом 60% 40% Сибсы с сахарным диабетом 20% 0% 4 a/4 a 4 a/4 b 4 b/4 b *** - Достоверность различий между группами с различным полиморфным вариантом строения гена e. NOS, p < 0, 001

II. Изучение индивидуальной чувствительности мозга к ишемии Гены программированной клеточной гибели • Гены митохондриального пути апоптоза (каспазы -3, 9, р53, bcl-2, bcl-xl АИФ, циохром С, APAF) • Гены маркеров повреждения ДНК (ПАРП-1) • Гены рецепторного пути апоптоза (Fas, FADD, каспаза-8) • Гены системы NOS (i-NOS) 2004 – 2009 гг.

Программированная клеточная гибель. Апоптоз

Формирование инфаркта мозга Ядро инфаркта Область «полутени» Тромб

Характеристика клеточной гибели Апоптоз Некроз Паттерн клет. гибели Единичные клетки Группа соседних клеток Размеры клетки «Высыхание» Набухание, отек Плазматическая мембрана Сохраняет целостность Сглаживание поверхности, лизис Митохондрии Повышается проницаемость мембран Структура сохранена Набухание мембраны; Нарушение структуры Форма Сморщивание «Апоптозные тельца» Набухание, разрушение Ядро Фрагментация хроматина Разрушение мембраны Разрушение ДНК Деградация клетки Межнуклеосомная фрагментация Фагоцитоз Нет воспаления Диффузная и беспорядочная фрагментация Воспаление Инвазия макрофагов

Характеристика апоптоза

Маркеры апоптоза • p 53 • Bax, Bad • caspases 3, 8, 9 • APAF-1, AIF апоптоз Антиапоптотические факторы • Nf cappa B • Bcl-xl • Bcl-2 рак

Fas Лиганд Мембрана 120— 150 минут после индукции Caspase-8 Pro-Caspase-8 TRAD Pro-Bid FAD D Bcl-2 Bcl-xl Bad F DD TNF Лиганд AP-1 Bid Bax AIF NF-kappa. B Р 53 Cyto Воспаление, выживание F Pro-Caspase-9 C d. ATP APAF-1 Caspase-9 APAF-1 Апо-некроз Caspase-3 F Pro-Caspase-3 Протеолизис I CA D ICAD CAD AIF Деградация высокомолекулярных субстанций Actin Fodrin PKC- d Деструкция цитозоля ДНК-PK PARP ДНК восстановление Цитозоль Интрануклеосомальная деградация Ядро

АПОПТОЗ Функции р53 АРЕСТ-РОСТ Активация р53 ДНК-стресс Онкоген-стресс Выключение р53 при опухоли Нет апоптоза РАК

Каспазы • Цистеиноваые протеазы, вызывающие клеточную гибель • Разрушают структуру белка, отвечающего за целостность клетки • Активация каспазы-3 ассоциирована с ишемией • Ингибиторы каспаз уменьшают объем нфартка даже через 3 -9 часов! • ? проникновение через ГЭБ

FAS рецептор Плазматическая мембрана Death Domain FADD Pro-caspase 8 индукция апоптоза TRADD TRAF-2 механизмы выживания

Размер инфаркта мозга достоверно уменьшается при торможении экспрессии гена p 53¹ (у трансгенных животных и при воздействии ингибитора - pifithrin-alpha 2 ) p 53 -/- Wild-type (2 Culmsee C, 2001) (1 Crumrine RC, 1994)

Клеточная мембрана ADP NADH Глюкоза Пируват ATP NAD ATP Истощение Подавление гликолиза и митохондриально го дыхания и некроз клетки ATP и NAD NMNAT NAD Чрезмерная активация PARP NMN NA ATP PARP Массированное повреждение ДНК

Исследование индивидуальной чувствительность головного мозга к ишемии 96 больных (славян из московской популяции) в первые 12 часов каротидного ишемического атеротромботического инсульта Изучение влияния полиморфных вариантов генов апоптоза на формирование инфаркта головного мозга

Структура гена р53 17 р 13. 1 5 -й экзон 137764 116464 5 экзон, сайт узнавания рестриктазы BAM HI RFLP Участок полиморфной замены Генотипы: -/+/+/+ Замена A/G в 5 -м экзоне

Магнитно-резонансная томография

Распределение объемов инфаркта мозга у пациентов с разными Rsa-I ПАРП-1 генотипами * *p=0, 04 -/- +/+/+ 1 -е сутки * -/- *p=0, 04 +/+/+ 3 -и сутки *p=0, 02 +/+/+ 21 -е сутки * -/- *p=0, 002 +/+/+ 7 -е сутки Согласно статистике Байеса у пациентов с генотипом Rsa-I / ПАРП-1 развитие обширного очага инфаркта можно прогнозировать с вероятностью более 65%

Распределение инфарктов мозга у пациентов с разными полиморфными вариантами гена ПАРП-1 в зависимости от локализации сосудистого поражения -/- эк-ВСА ик-ВСА СМА +/+ +/- эк-ВСА ик-ВСА СМА > 90 cм 3 эк-ВСА ик-ВСА СМА 40 - 90 cм 3 < 40 cм 3

Распределение инфарктов мозга у пациентов с разными Bam HI p 53 генотипами 1 -е сутки 3 -и сутки * p>0, 05 -/- p>0, 05 +/+/+ -/- 21 -е сутки * +/+/+ -/- 7 -е сутки *p=0, 008 p<0, 05 +/+/+ -/- У носителей (+) аллеля p 53, развитие очага инфаркта большого объема можно прогнозировать с вероятностью более 75%, в то время как у пациентов с / генотипом вероятность развития очага инфаркта малого объема составляет 65% Skvortsova V. et al. Restorative Neurology & Neuroscience 2004; 20: 1 5.

+/+ и +/- ПАРП-1 -/- р53 +/+ и +/- р53 -/- ПАРП-1

Анализ ассоциации комбинаций генотипов FADD, Fas, ПАРП-1 и р53 с объемом инфаркта головного мозга Полиморфные варианты генов Средний объем очага (см 3) FADD Fas ПАРП-1 p 53 А/A ; A/G G/G -/- +/+ ; +/- 62, 1 А/A ; A/G -/- +/+ ; +/- 142 * G/G А/A ; A/G -/- 142, 7 * А/A ; A/G G/G +/+ ; +/- 42, 8 А/A ; A/G -/- 30, 9 G/G А/A ; A/G -/- +/+ ; +/- 210, 1 * А/A ; A/G +/+ ; +/- 55, 3 А/A ; A/G G/G -/- 22 G/G А/A ; A/G +/+ ; +/- 89, 5 * G/G +/+ ; +/- 10, 5 А/A ; A/G G/G +/+ ; +/- -/- 4, 5 G/G -/- +/+ ; +/- 74, 3 * G/G А/A ; A/G +/+ ; +/- -/- 32, 8 А/A ; A/G +/+ ; +/- -/- 16, 3 G/G +/+ ; +/- -/- 28, 8

Распределение объемов инфаркта головного мозга у больных с разными комбинациями Rsa-I PARP-1 и Bam HI p 53 генотипов (день 3) Комбинация генотипов (-/-) Rsa-I PARP-1 and (-/-) Bam HI р53 genotypes (-/-) Rsa-I PARP-1 and (+/-); (+/+) Bam HI р53 genotypes * (+/-); (+/+) Rsa-I PARP-1 and p=0, 026 (+/-); (+/+) Bam HI р53 genotypes (+/-); (+/+) Rsa-I PARP-1 and (-/-) Bam HI р53 genotypes Средний объем (см 3); (частота, %) 56. 6 (16. 7%) 157. 6 (53. 3%) 87. 2 (26. 7%) 34. 4 (8. 3%) * р=0, 026 vs. комбинация [(+/-); (+/+) Rsa-I ПАРП-1 и (-/-) Bam HI р53]

мозгового кровотока ( СBF) [O 2 ] и [глюкозы] в ткани мозга [ATP], p. H, + [K ] e Деполяризация мембраны нейрона 2+ [ГАМК] [Са 2+] i . 2 . НЕКРОТИЧЕСКАЯ смерть

i. NOS gene knockout (i. NOS -/-) уменьшение зоны инфаркта Iadecola C. et al. J Neurosci 1997

Полиморфизмы гена i. NOS - 2447 C/G - 0. 7 (TAAA)n. D/I точка начала транскрипции 5’ 3’ e 16 150 C/T - 1659 C/T Ser 608 Leu 1659 C T

Зависимость относительной динамики объема инфаркта мозга на 1 -3 сутки от полиморфизма Ser 608 Leu (C/T) Примечание: * р=0, 03 по сравнению с С/C генотипом Ser 608 Leu

Выявление генетических маркеров индивидуальной чувствительности мозга к ишемии С/C генотип Ser 608 Leu (C/T) • Неблагоприятная динамика очага инфаркта мозга независимо от исходного объема • Отрицательная динамика в неврологическом статусе • Уменьшение степени функционального восстановление Т аллель (СТ/TT) Ser 608 Leu (C/T) • Благоприятная динамика очага инфаркта мозга независимо от исходного объема • Положительная динамика в неврологическом статусе • Увеличение степени функционального восстановления

Полногеномный анализ • широкомасштабный анализ полиморфизма генома • тотальный скрининг ОНП • суммарная оценка полиморфизмов генома • использование микрочипов высокой плотности (до 1 млн полиморфных сайтов)

Ближайшие перспективы развития молекулярной генетики • Полногеномное сканирование • Разработка микрочипов

Ближайшие перспективы развития молекулярной генетики

ГОУ ВПО РГМУ Росздрава Полногеномное сканирование, 2009 г Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН Институт молекулярной генетики РАН

Определение индивидуального генетического риска развития инсульта 1200 пациентов 1028 больных с ИИ 172 больных с ГИ • Женщин 676 • Мужчин 524 • Средний возраст 64 + 7, 8 лет • Анализ факторов риска • Тщательное физикальное, инструментальное и лабораторное исследование • Установление патогенетического варианта инсульта в соответствии с критериями TOAST

Ближайшие перспективы развития молекулярной генетики • Оценка индивидуального риска развития инсульта • Своевременная диспансеризация лиц с высоким риском • Проведение профилактических мероприятий