Методы выделения, очистки и определения активности

Методы выделения, очистки и определения активности ферментов. 1. Единицы активности ферментов. Методы определения активности 2. Источники ферментов и их локализация. 3. Методы выделения и очистки ферментов. а)методы дезинтеграции клеток и тканей; б)выделение ферментов (экстракция, высаливание, сдвиг температуры, р. Н); в) хроматографические методы; г) электрофорез.

Единицы активности ферментов • Стандартная единица активности - это такое количество фермента, которое катализирует превращение одного микромоля данного субстрата за одну минуту при заданных условиях. Для определения числа стандартных единиц фермента желательно пользоваться t =25 0 , р. Н оптимум, и Ссубст – оптимум. (U - латинское, Е – русское). • Официальная единица активности - Катал (кат) – количество фермента, которое превращает один моль субстрата в одну секунду. Это очень большая величина и активность фермента чаще выражают в микрокаталах: 1 мкат = 1 • 10 -6 кат • Удельная активность - это число единиц, отнесенное к одному миллиграмму белка в ферментом препарате. (U/mg, Е/мг белка) • Молекулярная активность - число молекул данного субстрата или эквивалентно затронутых групп, превращаемых за одну минуту одной молекулой фермента при оптимальной концентрации субстрата. Как следует из определения, для вычисления молекулярной активности фермента, нужно знать его молекулярную массу.

Изменение скорости убыли субстрата (или накопления продукта) при ферментативной реакции.

Причины замедления реакции 1. Так как в принципе каждая ферментативная реакция обратима, то в силу закона действующих масс скорость реакции равное произведению концентрации реагирующих веществ (и образующиеся продукты реакции будут влиять на скорость прямой реакции) 2. В процессе реакции концентрация исходного материала может оказаться ниже насыщающей концентрации и естественно скорость также будет замедляться. 3. Сам фермент во время реакции частично разрушаются и естественно уменьшается скорость реакции 4. Торможение продуктами реакции, даже если реакция необратима. В связи с выше изложенным, для точного определения скорости ферментативной реакции, измерение нужно проводить в начале реакции, когда количество превращенного субстрата не выше 20% от исходного.

Важнейшим условиями правильного определения истиной начальной скорости реакции являются: • - применение таких физических методов, которые дают возможность наблюдать за ходом реакции непрерывно (СФ, электропроводимость, потенциометрия, кондуктометрия и т. д. ); • - применение по возможности насыщающих концентрации субстрата (SO); • правильный подбор субстрата; • соблюдение условий проведения реакции (температура, перемешивание);

Методы дезинтеграции тканей и клеток • -механические: баллистический, экструзионный, декомпрессионный; • -физические: осмос и термошоки, плазмолиз, криотехника, ультразвук, сушка, ионизирующая радиация, температура; • -химические: действие кислот, щелочей, солей, органических растворителей, ПАВ, сдвиг р. Н; • -энзиматические: действие литических ферментов (лизоцим; • -биологические: действие фагов, антибиотиков.

Методы выделения и очистки ферментов 1. Методы выделения: • экстракция, высаливание, сдвиг температуры, р. Н 2. Методы очистки: • хроматография, электрофорез

Общая схема выделения и очистки ферментов.

Схема гель-хроматография ферментов различающихся по размерам.

Ионообменная хроматография ферментов

Схема аффинной хроматография ферментов различающихся по специфичности к лиганду.

Разделение ферментов методом электрофореза