Методы выделения и анализа РНК

Методы выделения и анализа РНК Горбачев Алексей Фисунов Глеб НИИ ФХМ 2012

Теория

Для жизнедеятельности клетки нужно: • Программа развития (генетический код, копирование) • Энергия (потребление нужных веществ из среды и выведение ненужных, метаболизм) • Регуляция и подстройка под изменение условий (экспрессия разных генов в разное время, включение выключение) • Защита от стрессовых воздейсвий (поддержание постоянства)

Центральная догма молекулярной биологии ДНК (генетический код) Транскрипция РНК (декодировка) Трансляция Белок (функция) Регуляция Метаболизм Защита

Пуриновое или пиримидиновое основание Фосфат Пентоза Рибоза OH ribose H deoxyribose Дезоксирибоза Нуклеозид Нуклеотид

ПУРИНЫ Аденин Гуанин ПИРИМИДИНЫ РНК: АУГЦ ДНК: АТГЦ Цитозин Урацил Тимин

Отличия ДНК и РНК Характеристика ДНК РНК Сахар дезоксирибоза рибоза Азотистые основания тимин урацил Структура Двойная спираль Одноцепочечная, (только 2 -ая структура) может образовывать 2 - ые и 3 -ые структуры Функции Хранение и передача Реализация генетической информации (синтез белка), регуляция, ферментативная функция (рибозимы)

Транскрипция

Транскрипция ДНК. Общий принцип.

Транскрипция ДНК. Общий принцип.

Структура бактериального промотора • Промотор место, с которым связывается РНК-полимераза • ТАТА-бокс • -35 -регион

Транскрипция у эукариот • Три РНК-полимеразы • На каждый тип РНК своя полимераза – RNApoly I - синтез пре-р. РНК – RNApoly II - синтез пре-м. РНК – RNApoly. III - синтез пре-т. РНК • Каждая полимераза имеет свою структуру промотора

Промотор РНК-полимеразы II • Инициаторная последовательность вокруг точки старта • TATA – бокс – 25 регион • TATA+Инициатор = коровый промотор • A Транскрипционные факторы связываются с ТАТА боксом до РНК-полимеразы

м. РНК Бактериальная м. РНК ORF 1 Спейсер ORF 2 P P P 5’UTR 3’UTR Эукариотическая Экзон Интрон м. РНК CAP P -AAAAAAA Кодирующая область CAP P -AAAAAAA Кодирующая область

р. РНК 16 S 23 S 5 S

т. РНК

тм. РНК

7 SL RNA

Практика

Лизис клеток • 4 М Гуанидин тиоцианат • Trizol/Tri реагент (ГТЦ + фенол) • Циркониевые шарики

Выделение РНК Малые РНК Экстракция Сорбция Фенол/Trizol 2 М Гуанидин p. H~4. 0 тиоцианат +Хлороформ РНК Сорбент Белок на основе Si. O 2 ДНК ДНК (4 М ГТЦ)

Фракционирование РНК Выделение поли-А РНК Сэндвич-гибридизация Сорбент Адаптер TTTTT ||||| AAAAA Целевая РНК

Осаждение РНК • Изопропанол • 1 М Li. Cl >300 нуклеотидов • Промывка 70 -80% этанолом

Детекция нуклеиновых кислот • Радиоактивное мечение – Р 32 -αATP • Флуоресцентное мечение – FAM – HEX – TAMRA – Цианины • Спектрофотометрическая детекция – 260 нм / 280 нм (белок) • Интеркалирующие красители – Et. Br – SYBR Green – Eva. Green – SYTO-82 • Иммуноферментная детекция

Детекция нуклеиновых кислот Преимущества Недостатки Высокая трудоёмкость Низкая производительность Радиоактивное Высокая чувствительность Опасность для мечение пользователя Ограниченная доступность метки Простота Флуоресцентнная Дешевизна Низкая чувствительность детекция Большой набор красителей Высокая трудоёмкость Низкая Иммуноферментная Высокая чувствительность производительность детекция Ограниченная доступность антител

Дот-блот гибридизация Денатурация РНК Формамид Формальдегид Зонд УФ Нитроцеллюлозная Кросс-сшивка мембрана

Nothern-blot гибридизация Электрофорез в Перенос на денатурирующих мембрану и кросс- условиях сшивка р. РНК УФ м. РНК т. РНК Зонд

Nothern-blot гибридизация

Nothern-blot гибридизация • Позволяет определить • Недостатки – Наличие РНК – Ограниченная чувствительность (зависит от способа детекции) – Приблизительную массу РНК – Ограниченная специфичность – Приблизительное количество РНК – Нет количественных результатов – Низкая производительность – Высокая трудоёмкость

In situ гибридизация Транскрипция с ПЦР мечеными Ген Транскрипц ия нуклеотидами Плазмида DIG Зонд (меченая РНК) Ген Детекция Хромогенн Гибридизаци антителами ая реакция я DIG

In situ гибридизация

Трёхмерная реконструкция пространственно- временного профиля транскрипции

In situ гибридизация • Позволяет определить • Недостатки – Наличие РНК – Ограниченная чувствительность (зависит от способа детекции) – Пространственное распределение РНК – Ограниченная специфичность – Приблизительное количество РНК – Нет количественных результатов – Низкая производительность – Высокая трудоёмкость

Primer extension Секвенирование Обратная Праймер транскрипция Праймер ДНК РНК Метка Акриламидный электрофорез

Primer extension

Primer extension • Позволяет определить • Недостатки – Точку старта – Ограниченная транскрипции чувствительность (зависит от способа детекции) – Низкая производительность – Высокая трудоёмкость

RACE • 5’-RACE – Определение 5’-концов • 3’-RACE – Определение 3’-концов

3’-RACE к. ДНК Олиго д. Т праймер TTTTT Адаптор ||||| AAAAA Обратная РНК транскрипция Геноспецифичный праймер к. ДНК Синтез второй цепи Геноспецифичный праймер ПЦР к. ДНК Праймер на адаптор

5’-RACE м. РНК CAP P P P Продукт OH расщепления, р. РНК TAP кислая фосфатаза тобака 3’ 5’ OH P Адаптор Т 4 РНК-лигаза м. РНК OH

5’-RACE Геноспецифичный праймер Адаптор Обратная транскрипция м. РНК Праймер на адаптор ПЦР к. ДНК Геноспецифичный праймер

RACE • Позволяет • Недостатки определить – Низкая – Точку старта производительность транскрипции – Точку терминации транскрипции – Направление транскрипции

Библиотека двуцепочечной к. ДНК

Вычитающая гибридизация к. ДНК Расщепление на короткие фрагменты к. ДНК Тестер А Тестер В

Вычитающая гибридизация 3’ 5’ Тестер OH P Лигирование адаптеров OH 5’ 3’

Вычитающая гибридизация Драйвер (избыток) Тестер А Тестер В Гибридизация

Вычитающая гибридизация Тестер А – Тестер А ПЦР Суппрессия Тестер В – Тестер В Тестер – Драйвер Линейная амплификация Драйвер – Драйвер Нет амплификации Тестер А – Тестер В Экспоненциальная амплификация

Вычитающая гибридизация • Позволяет • Недостатки определить – Низкая – Отличия одного пула чувствительность РНК от другого – Низкая производительность – Высокая трудоёмкость

Real-time PCR (Q-PCR) Обратная транскрипция к. ДНК Праймер РНК Интеркалирующий краситель Праймер ДНК-полимераза Плавление Отжиг Достройка Детекция

Real-time PCR (Q-PCR) Увеличение специфичности – четвёртая стадия Температура детекции

Real-time PCR (Q-PCR) Увеличение специфичности – использование зондов FRET Флуорофор Тушитель Праймер Зонд ДНК-полимераза Флуоресценция

Real-time PCR (Q-PCR) Кривая плавления Ампликон Неспецифический продукт

Real-time PCR (Q-PCR) обработка результатов Линейный вид Логарифмический вид

Q-PCR для бедных или полуколичественная ПЦР

Real-time PCR (Q-PCR) эффективность реакции и количественные измерения

Real-time PCR (Q-PCR) обработка результатов • Простой метод – R = (эффективность)ΔCt – Эффективность должна быть одинаковой • Метод Пфаффла – R = (эффективность)ΔCt target(опыт-контроль) / (эффективность)ΔCt reference(опыт-контроль)

Real-time PCR (Q-PCR) • Позволяет • Недостатки определить – Низкая – Количество РНК в производительность относительном или абсолютном – Повышенные выражении требования к дизайну праймеров и реакции в целом по сравнению с обычной ПЦР

Гибридизация на чипах Экспрессионный чип Tiling array Олигонуклеотид Ген

Гибридизация на чипах ДНК 1 ДНК 2 Cy-3 Cy-5

Гибридизация на чипах • Позволяет определить • Недостатки – Количество РНК в относительном или – Низкая специфичность абсолютном выражении – Необходимость в мощном – Направление транскрипции компьютерном обеспечении (для – Точки старта полногеномных чипов) транскрипции – Точки терминации транскрипции

Next-generation sequencing • Миллиарды реакций секвенирования за один прогон • Подсчёт встречаемости данной последовательности Встречаемость прочтений Геном

Next-generation sequencing

Next-generation sequencing • Позволяет определить • Недостатки – Количество РНК в относительном или – Высокая трудоёмкость абсолютном выражении – Необходимость в мощном – Направление транскрипции компьютерном обеспечении – Точки старта транскрипции – Точки терминации транскрипции

Tiling array RNA-Seq Точность Точность Покрытие