Методы оценки клеточной гибели.
Апоптоз- один из двух основных вариантов гибели клеток (апоптоз и некроз). Апоптоз является активной формой гибели клеток, которая обусловлена включением через сигнальные пути механизмов, приводящих к деградации генетического материала.
Механизмы запуска апаптоза: Внутренний – митохондриальный. 2) Рецепторный : 1) Fas (CD 95) – зависемый механизм; b. TNF-опосредованный механизм. a.
Определение апоптоза основано на регистрации следующих феноменов, лежащих в его основе: v Формирования разрывов ДНК v Развивающейся вследствие этого деградации и потери клеткой части ДНК v. Асимметрии мембраны с экспрессией на поверхности необычных молекул v Изменения морфологии клетки.
I. Морфологический метод Наиболее субъективным является морфологический метод оценки апоптоза: 1. По уменьшению объема клеток, 2. Уплотнению хроматина и мембраны, 3. Появлению апоптотических телец. Он может рассматриваться как ориентировочный, требующий подтверждения.
II. Электрофоретический метод регистрации разрывов ДНК. Состоит в электрофоретическом разделении ДНК, экстрагируемой из клетки и регистрации «лесенки» – фракций ДНК, кратных по размерам внутри нуклеосомы. Сейчас метод применяют ограничено, из-за появления более удобных и простых методов.
III. TUNEL-метод. Используют для регистрации накопления нерепарируемых разрывов ДНК. К свободным концам ДНК при участии фермента Td. T подшивается олигонуклеотиды с флуоресцентной или ферментной меткой. Метод используют при гистологических исследованиях. Применим для проточной цитометрии.
IV. Регистрация потери ДНК в тесте с применением пропидия йодида. Гиподиплоидия определяется по появлению пика левее диплоидного на гистограммах клеток, окрашенных флуорохромом, связывающимся с ДНК (пропидия йодидом).
1. 2. 3. 4. 5. Исследуемые клетки фиксируем охлажденным 70% этанолом 1 час. Отмываем клетки и помещаем в 96 луночный планшет. Добавляем: пропидия йодид в физ. Растворе, буфер, тритон, цитрат натрия. Инкубируем 15 минут Подвергаем проточной цитометрии, оценивая их численность в пике, располагающемся левее пика диплоидных клеток.
V. Окрашивание клеток аннексином V Определение экспрессии фосфатидилсерина, появляющегося на поверхности клеток из-за нарушения ассиметрии мембраны в процессе апоптоза с помощью аннексина V, меченного флуорохромом. Параллельно определяют некроз клеток по проницаемости для пропидия йодида, связывающегося с ДНК.
Ø Клетки культивируются в 96 -луночных планшетах. Ø Вводится фактор, вызывающий апоптоз. Ø Добавляется раствор, содержащий аннексин V, меченный ФИТЦ, пропидия йодид с буфером. Ø Инкубация 37 С, 15 минут, во влажной атмосфере. Ø Клетки отмываются и подвергаются двуцветной цитофлуометрии: 1) Зеленый - аннексин V. 2) Оранжевый - пропидия йодид. Ø Этот метод используют для определения природы клетки: вводят моноклональные антитела к маркерам клеток (анти CD 4, анти CD 8), меченные третьим флуорохромом.
Некротические клетки Клетки со смешанной формой гибели Апоптотические клетки
Клиническая значимость q Определение апоптоза и некроза желательно при подготовке клеток для инъекций (стволовые клетки; клетки для адаптивной цитотерапии). q При тестировании лекарственных препаратов (цитостатики для химиотерапии). q При анализе механизмов иммунодефицитных состояний желательно учитывать выраженность индукции апоптоза при активации лимфоцитов.
Скачать презентацию Методы оценки клеточной гибели Апоптоз- один из
Методы оценки клеточной гибели.pptx