Методы количественного учета микроорганизмов Прямые и косвенные

Методы количественного учета микроорганизмов Прямые и косвенные

Методы прямого счета Подсчет микроорганизмов в счетной камере l Подсчет клеток на фиксированных окрашенных мазках l Метод Брида l Подсчет микроорганизмов с использованием мембранных фильтров l

Позволяют более полно учитывать количество, но… l При этом определяются и живые, и мертвые клетки, и результаты подсчета могут быть не совсем точными.

Подсчет в камере Горяева-Тома l возможен только для клеток с достаточно крупными размерами l позволяет применять микроскопы с малым увеличением. l удобен для счета дрожжей, крупных бактерий и спор грибов.

Счетная камера Тома l имеет вид толстого предметного стекла, в центре которого находится стеклянная пластинка с выгравированной на ней сеткой l По обе стороны пластинки (а в некоторых камерах вокруг нее) расположена другая пластинка на 0. 1 мм выше первой.

Счетная камера Горяева—Тома а — вид сверху; l б — вид сбоку; l в — при малом увеличении микроскопа l

Капля суспензии l наносится на пластинку с сеткой l к боковой пластинке притирается покровное стекло. l Пространство, заключенное между покровным стеклом и пластинкой с сеткой, представляет собой камеру глубиной 0. 1 мм.

Счет клеток l подсчитывают все клетки, находящиеся внутри большого квадрата (по диагонали) и на пограничных линиях. l Если клетки пересекаются пограничной линией пополам, считают только на двух смежных сторонах квадрата, например, на нижней и левой.

Рекомендуется l клетки подсчитывать в десяти больших квадратах и умножить на 5 l или в 50 больших квадратах. l Объем 50 больших квадратов составляет 1 /5 мм 3.

Требования к суспензии l Слишком густые суспензии считать затруднительно, их следует разбавлять водой. Разведения учитывать при подсчетах. l Лучше пользоваться такими разведениями, при которых количество клеток в одном большом квадрате не превысит 20.

Дном камеры является пластинка с сеткой, l Она разделена на ряд больших квадратов площадью 1/400 мм 2. l Объем малого квадрата -1/400 мм 3, большого-16/400 = 1/250 мм 3.

Пример l Допустим, что в 50 больших квадратах (1/5 мм 3) было подсчитано 530 клеток. Тогда в 1 мм 3 будет 530 х 5 = 2650 клеток, l в 1 мл (см 3) - 2650 х 1000 = 2650000 клеток. l

Метод Брида (по ГЛ. Селиберу) l точно откалиброванной пипеткой отмеряют 0. 01 мл исследуемой жидкости l распределяют на площади в 1 см 2. l мазок сушат, фиксируют и красят метиленовой синью.

определяют площадь поля микроскопа l высчитывают, сколько раз она укладывается в 1 см 2. l При помощи окуляра-микрометра и объекта-микрометра определяют радиус поля зрения и высчитывают его площадь

Например, l при диаметре поля зрения, установленном по объектумикрометру на 0, 16 мм, l площадь поля зрения будет равна (с некоторым округлением) 0. 02 мм 2, что составляет 1/5000 см 2. l Эта площадь укладывается в 1 см 2 5000 раз.

Затем l при помощи иммерсионного объектива считают количество микроорганизмов в отдельных полях зрения микроскопа. l Поля зрения выбираются произвольно. l Подсчитывают количество клеток обычно в 30 полях зрения.

Пример l подсчитано в 30 полях - 630 клеток. l Следовательно, в одном содержится в среднем 21 клетка ( 630/30 = 21). l Отсюда количество клеток в 0. 01 мл исследуемой суспензии равно: 21 х 5000 = 105000. Значит в 1 мл: 105000 х 100 = 10500000 клеток.

Мембранные фильтры l впервые предложены в 30 -х гг. нашего столетия (Пирс, 1927; Элфорд, 1930, 1931). l для приготовления мягких фильтров, используют только растворы целлюлозы (нитроцеллюлозы) в различных растворителях.

Преимущество l мембранных фильтров заключается в возможности калибрования (градуирования), т. е. приготовления фильтров с заданной величиной пор.

Сущность метода в том, что через мембранные фильтры пропускается определенное количество воды l 10 -20 мл из чистых рек, озер и 1 мл - из загрязненных водоемов, сточных вод l Микроорганизмы на поверхности мембранных фильтров (после фильтрации) окрашивают и подсчитывают. l

Методика в настоящее время используются мембранные фильтры пяти различных градаций пористости 1 -5 от 0, 35 мкм до 1, 2 мкм l Перед употреблением фильтры стерилизуют медленным кипячением в течение 15 мин. l В воронку Уленгута наливают стерильно исследуемую жидкость и вставляют ее в колбу Бунзена, которая соединена с водоструйным наносом. l

После фильтрации l фильтр помещают в стерильную чашку Петри и окрашивают 1 -5%-ым раствором эритрозина в течение 3 -5 часов. l Затем фильтр осторожно промывают и помещают для просветления в чашку Петри (на фильтровальную бумагу) с кедровым или вазелиновым мае лом.

Подсчет производят с иммерсионной системой l l l в 30 -100 полях зрения Далее аналогично методу Брида определяют площадь поля зрения микроскопа, высчитывают, сколько раз оно укладывается в площади фильтра находят среднее количество микроорганизмов на поле зрения, пересчетывают количество микроорганизмов на всю поверхность фильтра на 1 мл исследуемой воды (жидкости).

Высев на плотные и жидкие питательные среды l учитываются только жизнеспособные клетки микроорганизмов, l выявить все разнообразие микроорганизмов субстрата на одной среде не удается вследствие существенных физиологических различий между ними. l Не существует универсальной среды

МЕТОДЫ ПОДСЧЕТА МИКРООРГАНИЗМОВ ПУТЕМ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Метод высева на плотные среды l Сущность метода заключается в высеве исследуемой пробы почвы на плотную среду в чашки Петри и последующем подсчете выросших колоний. l При этом считают, что каждая колония является результатом размножения одной клетки. l Если субстрат содержит большое количество микроорганизмов, то прибегают к разведениям.

Чашечный метод l широко используется для определения количества жизнеспособных микроорганизмов в почве и других естественных субстратах. l Применение его позволяет учесть не только численность микроорганизмов, но и оценить их разнообразие по морфологии колоний.

Разведения делают в стерильном 0. 5%- ом водном растворе хлористого натрия. l Чаще всего делают десятичные разведения. l Стерильный раствор разливают стерильной пипеткой по 9 мл в стерильные сухие пробирки. l Затем переносят стерильной пипеткой 1 мл исследуемого материала в пробирку с 9 мл раствора.

Степень разведения l устанавливается предполагаемым количеством микроорганизмов в образце: число разведений тем больше, чем больше микроорганизмов в исходном субстрате. l Для приготовления каждого разведения обязательно использовать отдельную пипетку.

Методика посева Стерильной пипеткой наносят определенный объем (обычно 0. 1, 0. 2 или 0. 5 мл) соответствующего разведения, предварительно тщательно перемешанного на поверхность агаровой пластинки в чашку Петри. l Данный объем распределяют по поверхности среды стерильным шпателем. l

Подсчет выросших колоний бактерий - производят на мясо-пептонном агаре при культивировании с температурой 30 °С через трое суток, при комнатной температуре через семь суток. l Дрожжей - проводят на сусло-агаре при комнатной температуре через семь суток. l грибов - на сусло-агаре при комнатной температуре через: 3 -5 суток (при температуре 25 °С l

Подсчитывают количество колоний, выросших в каждой чашке Петри l результаты параллельных высевов суммируют, делят на количество чашек. l вычисляют среднее число колоний, выросших при высеве из этого разведения. l делают пересчет на 1 г или 1 мл исходной среды. l

Лучшим разведением считают то, при высеве из которого на плотной питательной среде от 50 до 100 колоний. l Если число выросших колоний меньше 10, то эти результаты отбрасывают l Желательно, чтобы общее количество подсчитанных колоний при высеве из данного разведения было не менее 300. l

Метод предельных разведений l l l В пробирки или колбы с жидкой питательной средой вносят строго измеренный объем из различных разведений суспензии. Для работы используют последовательный ряд десятикратных разведений испытуемого материала. Разведения исходной суспензии готовят так же, как и для чашечного метода. После инкубации регистрируют наличие или отсутствии роста, результаты обрабатывают статистически с помощью специальной таблицы и затем рассчитывают число клеток, содержащихся в 1 г (1 мл) исходного субстрата.

Посев в жидкую питательную среду. Одинаковый объем питательной среды разливают в колбы или пробирки и стерилизуют. l Посев проводят из нескольких разведений с таким расчетом, чтобы в опыт попало то разведение, при высеве из которого рост будет во всех параллельных сосудах, l а также то последующее разведение, которое даст роста ни в одной из параллельных пробирок. l

Результаты l l l Количество посевного материала везде одинаково -1 мл. После инкубации отмечают наличие или отсутствие роста микроорганизмов по характерным для данной группы признакам визуально - по помутнению среды образованию пленки осадка, газовыделению

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ НА ФЭК Микроорганизмы в большинстве случаев не окрашены и почти прозрачны. l Уменьшение интенсивности света после прохождения через суспензию клеток связано главным образом с его рассеянием. l В определенных пределах количество света, рассеиваемого суспензией микроорганизмов, пропорционально содержанию клеток l

Определять количество клеток l по интенсивности светорассеяния возможно только для тех культур, l развитие которых вызывает равномерное помутнение среды, l не сопровождается заметным изменением формы и размеров клеток, l и образованием пленок мицелия или различных скоплений

Питательная среда Для определения клеток по светорассеянию, должна быть оптически прозрачной l выбирают светофильтр, обеспечивающий максимум пропускания света данной суспензией. l суспензии с высокой плотностью клеток перед 1 имерением светорассеяния следует разводить средой или водой. l

Для построения калибровочной кривой l измеряют величину светорассеяния суспензий различной плотности. l В каждой из суспензий определяют в счетной камере или по методу Брида количество клеток в I мл среды l или вес сухой биомассы в г/л (г/100 мл) питательной среды.

На миллиметровой бумаге l На основании полученных данных строят калибровочную кривую, l откладывая на оси ординат показания ФЭКа, l а на оси абсцисс - количество клеток, содержащихся в 1 мл среды, или биомассы в 1 г/л.

Оформление графика l l 1. 2. 3. 4. Для каждой культуры микроорганизмов строят свою калибровочную кривую. На графике показывают номер светофильтра, рабочее расстояние кюветы, дату построения графика и для какой культуры он составлен.

использование количественных методов l l 1. 2. 3. очень сложная и кропотливая работа. Она требует особой тщательности в проведении всех манипуляций большого количества исходных материалов обязательной статистической обработки полученных результатов.

Из каждого разведения l делают 4 -6 параллельных высевов. При параллельных посевах одного разведения можно пользоваться одной стерильной пипеткой и одним шпателем.