Методы изучения почвенных грибов II
Косвенные методы изучения грибов в почве • выделение на питательные среды, на которых возможно определение видового состава
Преимущества и недостатки косвенных методов + позволяют определять видовой состав грибов, растущих на используемых средах + дают количественную оценку их жизнеспособных пропагул (КОЕ) - дают заниженную оценку численности - не дают представления о происхождении колоний - не позволяют судить о реально развивающихся в почве видах - анализируется органичная проба, следовательно выявляется малая часть реального сообщества (неслучайная выборка)
Косвенными методами выявляется значительно меньшая численность микроорганизмов, по сравнению с методами прямого подсчета ПРИЧИНЫ: 1) селективность среды 2) межвидовая конкуренция 3) внутривидовые механизмы регуляции прорастания 4) подсчет прямыми методами нежизнеспособных пропагул
Комплекс почвенных микоромицетов • Комплекс почвенных организмов (в микологии микромицетов) это набор видов, выявляемых в изучаемом местообитании • Они не связаны друг с другом, следовательно не образуют сообщество • Значительная их часть, как правило, находится в покоящемся состоянии • В почвах всегда имеется избыточный запас микроорганизмов всех экологических и трофических групп, развитие большей части которых ограничено недостатком питания или неподходящими в данный момент условиями – пул микроорганизмов • Активный пул - пул микроорганизмов важных для протекания активных в данных условиях процессов • Пул сохранения - обеспечивающий выживание отдельных видов, развитию которых условия не благоприятствуют
Среды, используемые для выделения грибов Универсальные – подходят широкому кругу микроорганизмов Селективные – подходят ограниченной таксономической или трофической группе Бедные – содержат источник углерода в малых концентрациях или в трудно доступных формах Богатые – содержат достаточно легкодоступного углерода Синтетические – составляются из химически чистых веществ (среды определенного состава) Естественные – готовятся на основе природных субстратов (среды неопределенного состава) Стандартные среды для идентификации видов отдельных родов грибов
Подавление роста определенных групп почвенных микроорганизмов Добавки к средам: – Органические кислоты – красители – Антибиотики – Фунгициды – Параморфогены (тритон Х 100, желчные кислоты)
Посев почвы без предварительной обработки • Метод почвенных комочков (Hagem, 1908, 1910) • Метод почвенного мелкозема по Новогрудскому (1947) Д. М. • Метод почвенных пластин или прямой посев почвы (Warcup, 1950) • Метод почвенных отпечатков (Tresner, Hayes, 1970)
Посев из предварительно подготовленной почвы • Посев из почвенной суспензии 1902) (Oudemans, Koning, • Метод почвенных (серийных) разведений З. Ваксмана (Waksman, 1932) в модификации Д. Г. Звягенцева (1980) • Метод предельных разведений (Mc Сredi, Аристовская и др. , 1962) • Выделение на мембранных фильтрах (Davey, Wilde, 1935) • Отмывание почвы (Parkinson, Williams, 1961) в модификации (Gams, Domsch, 1967) • Смешивание со стерильным песком (Jonson, Manka, 1961)
Методы десорбции микроорганизмов с поверхности почвенных частиц • Механическое растирание • Перемешивание на качалке • Химическая десорбция (поверхностно активные вещества и др. ) • Замораживание – оттаивание • Обработка ультрозвуком
Метод посева из серийных разведений Литвинов М. А. Методы изучения почвенных микроскопических грибов. Л. : Наука, 1969. 120 с. Методы почвенной микробиологии и биохимии. (ред. Звягинцев Д. Г. ). Москва: Издательство МГУ, 1991. 304 с.
Загущенный посев Нормальный посев Слишком разведенный посев
Расчет количества КОЕ • формула для расчета количество пропагул или КОЕ (колониеобразующих единиц) бактерий, актиномицетов и грибов на 1 г воздушно сухой почвы X= _a c_ v m a – среднее количество колоний на чашке Петри v – объем наносимой суспензии c – разведение почвенной суспензии m – вес почвы, взятой для анализа
Зависимость числа выявленных видов от числа изолятов (подсчитанных колоний) Gams W. The analysis of communities of saprophytic microfungi with special reference to soil fungi // Fungi in Vegetation Sciense. W. Winterhoff (ed. ). 1992. P. 183 -223.
Метод отмывки почвы Gams W. The analysis of communities of saprophytic microfungi with special reference to soil fungi // Fungi in Vegetation Sciense. W. Winterhoff (ed. ). 1992. Kluwer Academic Publishers. Netherlands. P. 183 -223.
Метод приманок Используется как в полевых, так и в лабораторных условиях кусочки древесины бумага кератин- содержащие субстраты растительные остатки овощи, фрукты полимерные материалы и т. д.
Методы выделения с погруженных в почву субстратов (приманок) • Измельчение и приготовление суспензии с последующими разведениями • Выделение кусочков • Смыв • Отпечаток из
«Сукцессионный анализ» или метод инициированных сообществ • Моделирование реакции почвенного сообщества – на изменение условий (температуры влажности и т. д. ) – на внесение питательных веществ – на внесение ксенобиотиков – на внедрение интродуцентов – и т. п.
Подсчет выделенных колоний определенных морфологических типов
Выделение культуры и идентификация • Посев тремя уколами только на стандартные среды для идентификации данной группы (вариабельность признаков) • Проверка чистоты культуры – сопутствующие бактерии, скрытые микофилы, (Особенно важно для биохимических и генетических исследований). • Использование современных определителей, баз данных для проверки правильности написания и легальности названия • Проверка специалистом • Сохранение штамма для возможности проверки, пополнения коллекций и возможно изучения его физиологии или поиска биологически активных веществ.
Посев для идентификации
Описание культуральных и микроскопических признаков
Проверка чистоты культуры
Хранение культур • В пробирках на скошенном агаре (на косяках) • В почве • На целлюлозных полосках • На силикагеле • Лиофилизация • Замораживание • Хранение в жидком азоте
Обработка полученных данных • Количество КОЕ на 1 г воздушно сухой почвы • Список видов (таксономический, алфавитный, ранжированный) • Представленность видов • Меры разнообразия (индексы, соответствия моделям) • Выявление структуры комплекса микромицетов • Сравнение групп образцов из различных местообитаний (кластерный анализ, факторный анализ) • Анализ списка (наличие определенных видов – продуцентов, патогенных, индикаторных и др. )
Список видов
Меры количественной представленности видов Обилие вида - (плотность популяции) А а = –––– × 100% N А – обнаруженное число колоний данного вида N – число колоний всех выявленных видов Пространственная частота встречаемости – А Na = ––– × 100% N А – количество образцов, содержащих данный вид N – общее количество исследованных образцов Временная частота встречаемости Аt Na-t= –––– × 100% Nt Аt – количество сроков исследования, в которые появлялся данный вид Nt – общее количество сроков исследования
Критерии структуры комплекса почвенных микромицетов (Мирчинк и др. , 1982)
Комплекс почвенных грибов Комплекс типичных видов Мирчинк Т. Г. Почвенная микология. Москва: Издательство МГУ, 1988
Методы оценки разнообразия Индекс разнообразия Шеннона Н’ = -∑рi ln pi pi – относительное обилие iтого вида (ni/N) Изменяется от 0 до 6, обычно от 1, 5 до 3, 5 очень редко до 4, 5 Индекс разнообразия Бриллуена ln. N! – ∑ln ni! Нв = ––––––– N N – общее число особей (выделенных колоний) ni – число особей (колоний) i-того вида Изменяется как и индекс Шеннона Выровненность выборки рассчитанная по индексу Шеннона (по Пиелу) E = H’/ln. S H’ – индекс Шеннона S – число видов Изменяется от 0 до 1 (1 – соответствует ситуации равного обилия всех видов) Индекс доминирования Симпсона ni(ni– 1) D = ∑ ––––– N(N – 1) ni – число особей i-того вида N – общее число особей 1 Обратная форма = ––– D Обычно не превышает 10
Графики рангового распределения видов
Коэффициенты сходства видового состава комплексов микромицетов Коэффициент Жаккара Коэффициент Сьёренсена (Качественные данные) j – число общих видов а – число видов в первой выборке b – число видов во второй выборке j – число общих видов в сравниваемых выборках а – число видов в первой выборке b – число видов во второй выборке j Cj = ––––––– a+b-j Изменяется от 0 (нет сходства) до 1(полная идентичность списков) (в долях от 1 или в %) Коэффициент Маундфорда (Качественные данные) 2 j Cm= ——————— 2 ab-(a+b)j j – число общих видов в сравниваемых выборках а – число видов в первой выборке b – число видов во второй выборке 2 j Cs= ––––––– a+b Коэффициент Сьёренсена – Чекановского (Количественые данные) 2 j. Nmin Cs-ch = ––––– a. N + b. N j. Nmin – сумма меньших количеств особей общих видов в сравниваемых выборках a. N – сумма количества особей видов в первой выборке b. N – сумма количества особей видов во второй выборке
Сравнение местообитаний
Методы анализа разнообразия почвенных микроорганизмов без идентификации видов • Анализ разнообразия по морфотипам колоний • Определение структуры комплекса грибов и актиномицетов по линейной скорости роста колоний • Методом анализа тотальной ДНК почвы • Методом определения профиля жирных кислот • И др.
Для полного исследования почвенных грибов необходимо: • Обязательное сочетание прямых и косвенных методов • Максимально возможный набор питательных сред • Биохимические методы • Создание коллекции видов • Изучение свойств полученных культур
Методы изучения почвенных грибов достаточно универсальны и лежат в основе изучения грибов на любых субстратах
Литература Великанов Л. Л. , Сидорова И. И. , Успенская Г. Д. Полевая практика по экологии грибов и лишайников. М. : МГУ, 1980. 110 с. Кураков А. В. Методы выделения и характеристики комплексов микроскопических грибов наземных экосистем. М. : МАКС Пресс. 2001. 91 стр. Литвинов М. А. Методы изучения почвенных микроскопических грибов. Л. : Наука, 1969. 120 с. Мегарран Э. Экологическое разнообразие и его измерение. М. : Мир, 1992. 181 с. Методы почвенной микробиологии и биохимии. (ред. Звягинцев Д. Г. ). Москва: Издательство МГУ, 1991. 304 с. Методы экспериментальной микологии. Киев: Наукова Думка, 1978. 239 с. Методы экспериментальной микологии. Справочник. Киев: Наукова Думка, Билай В. И. (ред. ) 1982. 550 с. Мирчинк Т. Г. Почвенная микология. Москва: Издательство МГУ, 1988. 220 с. Мирчинк Т. Г. , Озерская С. М. , Марфенина О. Е. Выявление комплексов микроскопических грибов по их структуре // Научные доклады высшей школы. Биологические науки. 1982. № 11. С. 61 -66. Мирчинк Т. Г. , Пнников Н. С. Современные подходы к оценке биомассы и продуктивности грибов и бактерий в почве. // Успехи микробиол. , -1985, - Т. 20, - С. 198 -226 Разумовская З. Г. , Чижик Г. Я. , Громов Б. В. Лабораторные занятия по почвенной микробиологии. Л. : Изд-во ЛГУ, 1960. С. 138– 140. Струнникова О. К. , Шахназарова В. Ю. , Вишневская Н. А. , Муромцев Г. С. Применение мембранных фильтров и иммунофлюоресцентного окрашивания для наблюдения за развитием почвообитающих микромицетов. // Микология и фитопатология. 1998. Т. 32, вып. 2. Стр. 65 -72. Сэги Й. Методы почвенной микробиологии. М. : Колос. 296 с. Холодный Н. Г. Методы непосредственного наблюдения в почвенной микробиологии // Микробиология. 1935. Т. 4. Вып. 1. № 4. С. 75– 79. Gams W. et al. , ed. CBS course of mycology, fourth edition. 1998. 165 pp. ,
Скачать презентацию Методы изучения почвенных грибов II Косвенные методы
02Методы изучения почвенных грибов.ppt