Методы исследования уровня экспрессии генов Васильев Геннадий Владимирович

Методы исследования уровня экспрессии генов Васильев Геннадий Владимирович Институт цитологии и генетики СО РАН

Нозерн-блот анализ (Nothern-blot) Гибридизация с радиоактивно меченым зондом Разделение РНК в денатурирующем геле по размеру Результат авторадиографии Перенос РНК на нитроцеллюлозный фильтр Отмывка от несвязавшегося зонда

Нозерн-блот анализ (Nothern-blot) Преимущества метода 1. 2. 3. Довольно точная оценка экспрессии гена Сравнительный анализ нескольких образцов Возможность оценить не только наличие, но и размер транскрипта (транскриптов) Недостатки метода 1. 2. 3. 4. Недостаточная чувствительность метода Необходимы довольно большие количества суммарной РНК Необходимость работать с радиоактивными изотопами. Редкие и слабо представленные РНК не выявляются, что может приводить к ложноотрицательному результату.

Представленность различных м. РНК 1% Многокопийные м. РНК «редкие» м. РНК

Методы на основе ПЦР Качественные: 1. Дифференциальный дисплей 2. Неконкурентная мультиплексная ПЦР Полуколичественные: 1. Конкурентная мультиплексная ПЦР 2. Анализ с помощью микрочипов Количественный: 1. ПЦР в реальном времени (Real-time PCR)

Реакция обратной транскрипции 3’ м. РНК поли A хвост oligo d. T праймер Реакция обратной транскрипции – синтез к. ДНК по матрице м. РНК к. ДНК

Полимеразная цепная реакция Прямой 5’ праймер обратный праймер 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’

Полимеразная цепная реакция Наработка специфического продукта. Теоретицеский коэффициент размножения – 2 Реальный коэффициент размножения в хорошо оптимизированных условиях– 1, 6 -1, 4.

Дифференциальный дисплей Образцы м. РНК синтез к. ДНК ПЦР реакция с использованием комбинации случайных праймеров

Дифференциальный дисплей Преимущества метода 1. 2. 3. 4. Проведение сравнительного анализа Анализ экспрессии сразу большого количества генов Теоретически возможно идентифицировать все неизвестные транскрипты Низкая стоимость используемых реактивов Недостатки метода 1. 2. 3. Получение качественных, а не количественных данных Большая трудоёмкость метода За счет конкуренции за d. NTP и фермент не выявляются “редкие” малокопийные м. РНК

Неконкурентная мультиплексная ПЦР 1 2 3 Фрагмент А Контрольный фрагмент Интенсивность полосы А Интенсивность контрольной полосы Неконкурентная мультиплексная ПЦР является методом относительной оценки экспрессии генов. Используют две пары специфических праймеров в одной реакции. В качестве контроля выступают гены, экспрессия которых слабо меняется в условиях эксперимента.

Особенности ПЦР, искажающие количественные показатели • Существование фазы «плато» • Уровень плато определяется множеством параметров • Высокая чувствительность метода • Чувствительность ферментов к загрязнениям и изменению условий • Низкая чувствительность метода детекции (окраска бромистым этидием). Для фрагментов длиной менее 300 п. н. детектируемые количества продукта нарабатываются уже в районе перегиба, а не в линейной фазе реакции • Различия в эффективности амплификации фрагментов разной длины и разного нуклеотидного состава. При разнице эффективности амплификации двух фрагментов 5% изменение относительных концентраций уже на 25 цикле составит 3, 6 раза. При 10% - 14 раз При 15% - 58 раз.

Конкурентная мультиплексная ПЦР Оба продукта ПЦР синтезируются с ОДНИХ и тех же праймеров. Конкурентная ДНК добавляется в реакции серией заранее известных разведений

Мультиплексная ПЦР Преимущества метода • • Довольно точная оценка экспрессии гена (возможно обнаружить двукратные различия при статистической обработке результатов) Метод достаточно дёшев, прост и быстр. Возможно оценить экспрессию редких и слабо представленных м. РНК Требуется малое количество исходного материала Недостатки метода • • • Главный недостаток – сильная подверженность влиянию «синдрома китайского студента» . Точность метода сильно зависит от квалификации и подготовки исследователя, что не является объективным критерием. На точности метода сильно сказываются недостаточно чувствительные методы детекции

Скрининг изменений экспрессии с помощью микрочипов Микрочипы – стеклянные пластинки с иммобилизоваными короткими фрагментами ДНК Олигонуклеотидные На основе участков к. ДНК

Скрининг изменений экспрессии с помощью микрочипов

Скрининг изменений экспрессии с помощью микрочипов

Скрининг изменений экспрессии с помощью микрочипов Преимущества метода • • • Быстрый скрининг по большому количеству генов Наличие уже готовых панелей с различными целевыми наборами зондов. Возможность автоматизации процедуры Недостатки метода • • Слабая воспроизводимость Высокие уровни ошибок пере- и недопредсказания Результаты необходимо перепроверять методом Real-time PCR Цена

Real-time PCR с использованием Taq-Man зондов.

ПЦР в реальном времени (Real-time PCR) Детекция продукта производится в режиме реального времени по флуоресценции возбуждаемого лазером красителя непосредственно в реакционной смеси. Упрощённая модификация метода – использование интеркалирующего красителя SYBR-green. Образование целевого продукта отслеживается при построении кривой плавления. Высокая чувствительность метода позволяет гарантированно снимать показания на линейной части кривой, до выхода реакции на плато.

Real-time PCR с использованием Taq-Man зондов. Преимущества метода 1. 2. 3. Точный метод оценки уровня экспрессии гена Возможен сравнительный анализ экспрессии нескольких (до 4) генов в одной пробе при использовании разных флуоресцентных красителей Быстрота получения результата. Недостатки метода 1. 2. Сложности с выбором зондов Цена

Super. SAGE - serial analysis of gene expression • • Синтез к. ДНК Разрезание первой рестриктазой Лигирование с линкером, содержащим сайт Eco 15 I Рестрикция ферментом Eco 15 I Лигирование с образованием ди-тагов Приготовление библиотек Скавенирование

Прямое измерение уровня экспрессии с помощью методов высокопроизводительного секвенирования • • • Синтез к. ДНК Лигирование и дробление Создание библиотек для секвенирования ПЦР в эмульсии Секвенирование Выравнивание и подсчёт копийности P 1 P 2

Прямое измерение уровня экспрессии с помощью методов высокопроизводительного секвенирования Метод, свободный от начальной гипотезы Быстрый и сравнительно недорогой скрининг транскриптома без предварительных его исследований. Возможность прямого сравнения экспрессии интересующих групп генов. Идентификация групп генов, скоординированно меняющих свою экспрессию. Наглядная классификация транскриптов по функциям и группам. Обнаружение кластеров скоординированно меняющих экспрессию генов, не связанных общей функцией Freed 2008

Прямое измерение уровня экспрессии с помощью методов высокопроизводительного секвенирования Относительная обеднённость/обогащённость определёнными последовательностями в библиотеках для MPSS

Факт для размышлений