Методы исследования системы гемостаза Доцент кафедры клинической лабораторной диагностики Ор. ГМА, к. м. н. М. А. Белова
КОМПОНЕНТЫ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА Стенка кровеносных сосудов Тромбоциты Плазменные системы: -свертывающая -противосвертывающая -фибринолитическая
Диагностика нарушений системы гемостаза Методы, характеризующие сосудисто-тромбоцитарный гемостаз (исследование состояния сосудов –проба «щипка» , проба Кончаловского Румпель Лееде; исследование тромбоцитарного компонента длительность кровотечения по Дуке из микрососудов кожи, подсчет количества тромбоцитов в крови, изучение их морфологии, исследование агрегации тромбоцитов с индукторами и без индукторов агрегации) Методы оценки коагуляционного гемостаза (выявление аномалий, дефицита факторов свертывания, наличие ингибиторов свертывания) Методы оценки противосвертывающей системы (определение основных физиологических антикоагулянтов АТ III, протеинов S и С и др. ) Оценка фибринолитической активности крови (скорость лизиса эуглобулиновых фракций, степень фибринолитической активности в %) Выявление маркеров активации сосудистого свертывания крови и активации фибринолиза (выявление РФМК, продуктов деградации фибриногена и фибрина протаминсульфатный тест, этаноловый тест, ПДФ, Д димер)
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ КОАГУЛЯЦИОННОГО ГЕМОСТАЗА
Методы исследования коагуляционного гемостаза Клоттинговые тесты основаны на определении времени образования сгустка фибрина (клоттингового времени) Хромогенные тесты (амидолитические) основаны на определении активности протеаз системы гемостаза по их способности расщеплять хромогенный субстрат синтетический пептид, связанный с красителем. При действии соответствующей протеазы молекула красителя отщепляется от пептидной цепи и развивается окрашивание. Интенсивность окраски пропорциональна активности фермента и мо жет быть определена спектрофотометрически Иммунологические методы - позволяют выявить уровень искомого антигена или антител. Методы, основанные на других принципах
Время свертывания цельной крови (по Ли-Уайт) Принцип: определяют время свертывания цельной нестабилизированной венозной крови. Нормальные величины: 5 -10 мин. Клиническое значение : Характеризует состояние системы гемостаза в целом. Укорочение ВСЦК (гиперкоагуляция) возникает при Ш активации свертывающей системы Ш дефиците антикоагулянтов в организме Ш снижении активности фибринолиза Удлинение ВСЦК (гипокоагуляция) возникает при Ш врожденном и приобретенном дефиците факторов свертывающей системы Ш избытке антикоагулянтов (лечение антикоагулянтами) Ш выраженной активации фибринолитической системы кровь сгусток сыворотка
Определение времени свертывания крови по Моравицу
Определение времени свертывания крови по Моравицу
Схема свертывания крови (коагуляционный гемостаз) Фазы свертывания крови 1. Образование протромбиназного комплекса Внутренний путь (XIIа, XIа, IXа, VIIIа, ПК, ВМК) Х Внешний путь (III, VIIа) Ха , Vа, Са 2+, 3 тр Активная протромбиназа 2. Образование тромбина 3. Образование фибрина II фибриноген IIа (тромбин) фибрин
Активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ, АПТВ, каолин – кефалиновое время) Принцип: определяют время свертывания бедной тромбоцитами цитратной плазмы при добавлении оптимального количества кальция в условиях стандартной контактной (каолином) и фосфолипидной каолин (эритрофосфатид – заменяет ф. 3 тромбоцитов) активации процесса свертывания Нормальные величины: 27 -35 сек. Клиническое значение : АЧТВ позволяет измерить факторы внутреннего (XII, XI, IX, VIII, ПК, ВМК) и общего пути (X, V, II, I) свертывания крови. Внутренний путь (XII, XI, IX, VIII, ПК, ВМК) Ха , Vа, Са 2+, 3 тр Х АЧТВ возрастает при: Ш дефиците факторов внутреннего пути (XII, ПК, ВМК, XI, IX и VIII); Ш дефиците факторов общего пути (X, V, II, I). Ш наличии ингибиторов свертывания Внешний путь (III, VII) II Фибрино ген IIа фибрин При увеличении АЧТВ свыше 60 с и при нормальном количестве фибриногена проводят коррекционноингибиторные пробы (микст-тест), которые позволяют выявить дефицит факторов свертывания или наличие ингибитора Белова М. А.
Заменная проба на основе АЧТВ дифференциальная диагностика между дефицитом фактора или присутствием ингибитора (волчаночного антикоагулянта) в плазме
Принцип проведения заменной пробы К плазме больного гемофилией добавляются плазмы, дефицитные по одному из факторов плазменного гемостаза. Если АЧТВ после добавления заменной пробы не восстанавливается, то в плазме больного и дефицитной плазме отсутствует один и тот же фактор. Если АЧТВ восстанавливается, значит в плазме больного отсутствует другой плазменный фактор
Схема свертывания крови (коагуляционный гемостаз) Фазы свертывания крови 1. Образование протромбиназного комплекса Внутренний путь (XII, XI, IX, VIII, ПК, ВМК) Внешний путь (III, VII) АТ-III Х Ха , Vа, Са 2+, 3 тр II IIа (тромбин) 3. Образование фибрина фибриноген АТ - II I 2. Образование тромбина АТ -II I Активная протромбиназа фибрин
Определение протромбиновой активности (ПТ протромбиновый тест, ПВ протромбиновое время) Принцип: определяют время свертывания бедной тромбоцитами цитратной плазмы при добавлении оптимального количества кальция и избытка тканевого тромбопластина. Клиническое значение : ПТ имитирует внешний путь свертывания крови и не учитывает состояние факторов внутреннего пути. Этот тест позволяет оценить фактор VII (внешний путь коагуляции) и факторы X, V, II, I (общего пути). ПВ увеличено при наследственном дефиците факторов VII, X, V, II, I приобретенном дефиците факторов (дефицит витамина К, пероральное применение антикоагулянтов) Тканевой тромбопластин Внутренний путь (XII, XI, IX, VIII, ПК, ВМК) Внешний путь (III, VII) Ха , Vа, Са 2+, 3 тр Х II Фибрино ген IIа фибрин Белова М. А.
Способы выражения результатов протромбинового теста v время свертывания в секундах (нормальное значение ПВ -12 -20 сек в зависимости от активности тромбопластина) v протромбиновое отношение (нормальное значение ПО - 0, 9 -1, 1) время свертывания крови больного ПО = ––––––––––––––– время свертывания нормальной плазмы v% протромбинового индекса (нормальное значение ПИ - 90 -105%) время свертывания нормальной плазмы ПИ = ––––––––––––––––––––х 100 время свертывания крови больного v процент от нормы по Квику (нормальное значение протромбина по Квику в % по графику 70 -130%) - активность факторов протромбинового комплекса в % по калибровочному графику, построенному в результате измерения ПВ в разведенных растворах нормальной плазмы. v международное нормализованное отношение (MHO).
Международное нормализованное отношение (МНО) ПВ пациента, сек МНО= –––––––– Нормальное ПВ, сек МИЧ = ПОмич МИЧ= международный индекс чувствительности тромбопластина. §Результат не зависит от используемого реагента (тромбопластина) §Возможно сравнение результатов, полученных в разных лабораториях
Рекомендации ВОЗ для контроля уровня антикоагулянтов Клиническое состояние Рекомендуемое МНО Профилактика первичного и повторного тромбоза глубоких вен и легочной тромбоэмболии 2, 5 (2, 0 -3, 0) Предоперационная подготовка: хирургические вмешательства в области бедра 2, 0 (2, 0 -3, 0) Все остальные хирургические вмешательства 2, 5 (1, 5 -2, 5) Лечение тромбоза глубоких вен, легочной тромбоэмболии и профилактика повторного венозного тромбоза. 3, 0 (2, 0 -4, 0) Профилактика артериальной тромбоэмболии, включая пациентов с искусственными клапанами 3, 5 (3, 0 -4, 5)
Терапевтический диапазон МНО для контроля уровня антикоагулянтов Рекомендации Всероссийской ассоциации по изучению тромбозов, геморрагий и патологии сосудов (Москва, 27 -28 марта 2002 г) Профилактика тромбоза на фоне химиотерапии IV стадии рака молочной железы Первичная профилактика инфаркта миокарда у лиц высокого риска сердечно -сосудистых заболеваний, не способных принимать антиагреганты ––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Профилактика венозного тромбоэмболизма у пациентов высокого риска Лечение венозного тромбоэмболизма и ТЭЛА Профилактика и лечение тромбоэмболий при мерцательной аритмии, сердечной недостаточности, кардиомиопатии ––––––––––––––––––––––––––––––––––––– При механических протезах клапанов сердца первого поколения При механических протезах клапанов сердца второго поколения ––––––––––––––––––––––––––––––––––––– При биопротезах клапанов сердца При остром переднем Q-инфаркте миокарда Вторичная профилактика инфаркта миокарда у лиц, не способных принимать антиагреганты Критическая ишемия нижних конечностей ––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Профилактика рецидивов венозного, кардиогенного или артериального тромбоэмболизма ––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Профилактика тромбозов при антифосфолипидном синдроме 1, 6 (1, 3 -1, 9) 2, 5 (2, 0 -3, 0) 3, 5 (3, 0 -4, 5) 3, 0 (2, 5 -3, 5) 2, 5 (2, 0 -3, 0) 2, 0 -4, 0 + аспирин 3, 0 (2, 5 -3, 5)
Определение протромбиновой активности ПТ отражает состояние активности трех витамин-К зависимых факторов (VII, X, II), поэтому используется для контроля за терапией непрямыми антикоагулянтами Внутренний путь (XII, XI, IX, VIII, ПК, ВМК) Внешний путь (III, VII) Ха , Vа, Са 2+, 3 тр Х II IIа тромбин Фибрино ген фибрин Белова М. А.
Тромбиновое время (ТВ) Принцип: определяют время свертывания бедной тромбоцитами цитратной плазмы при добавлении стандартного количества тромбина. Нормальные величины : в плазме в норме 28 -32 сек Клиническое значение : Это время, необходимое для образования сгустка фибрина в плазме при добавлении к ней тромбина. Оно зависит только от концентрации фибриногена и активности ингибиторов тромбина (антитромбин III, гепарин, парапротеины). В клинике используется для: Ш контроля за гепаринотерапией; Ш контроля за фибринолитической терапией; Ш диагностики гиперфибринолитических состояний; Ш диагностики афибриногенемии и дисфибриногенемии. Белова М. А. Внутренний путь (XII, XI, IX, VIII, ПК, ВМК) Х Внешний путь (III, VII) Ха , Vа, Са 2+, 3 тр IIа тромбин IIа II Фибрино ген фибрин
Интерпретация результатов АЧТВ и ПТ АЧТВ норма удлиненное ПТ ПТ норма удлиненное Нет дефектов в свертывающей системе Дефицит фактора VII норма 1. Дефицит факторов внутреннего пути 2. Циркуляция антикоагулянта 3. Наличие гепарина в плазме удлиненное 1. Дефицит факторов общего пути X, V, II, I 2. Циркуляция антикоагулянта 3. Наличие гепарина в плазме
Схема свертывания крови (коагуляционный гемостаз) Фазы свертывания крови Внутренний путь (XII, XI, IX, VIII, ПК, ВМК) 1. Образование протромбиназного комплекса Pr. C, Pr. S Х Внешний путь (III, VII) Pr. C, Pr. S Ха , Vа, Са 2+, 3 тр Активная протромбиназа 2. Образование тромбина 3. Образование фибрина II фибриноген IIа (тромбин) фибрин
Концентрация фибриногена в плазме Концентрация фибриногена в плазме : 2 - 4 г/л Синтезируется в печени Быстрообновляемый белок: период полураспада 3, 5 -4 дня Белок острой фазы Независимый фактор риска инфаркта миокарда и инсульта Кофактор агрегации тромбоцитов, фактор коагуляции Фактор вязкости крови
Методы определения фибриногена Функциональные (основаны на превращении фибриногена плазмы в фибрин посредством рекальцификации, добавления тромбопластина и др. ) – занимают ведущее место в диагностике Нефункциональные (осаждение фибриногена путем высаливания или тепловой денатурации, паракоагуляционные, иммунологические)
Методы определения фибриногена Хронометрический метод (по Клауссу) – определяют время свертывания разведенной цитратной плазмы при добавлении избытка высокоактивного тромбина. Время свертывания зависит от концентрации фибриногена в плазме, которую определяют по калибровочному графику.
СНИЖЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ФИБРИНОГЕНА: § острый ДВС синдром; § дисфибриногенемии. ПОВЫШЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ФИБРИНОГЕНА: § инфекционные, воспалительные и аутоиммунные процессы; § подострый и хронический ДВС синдром; § нормально протекающая беременность.
Определение физиологических антикоагулянтов
Основные первичные физиологические антикоагулянты Наименование антикоагулянта Механизмы действия Антитромбин III (AT III) Прогрессивно действующий ингибитор тромбина фактора Ха и в меньшей степени других ферментных факторов свертывания. Плазменный кофактор гепарина Гепарин Сульфатированный полисахарид, образующий комплексы с AT III, переводящий последний в быстродействующий антикоагулянт Кофактор гепарина II Слабый антикоагулянт, действие которого выявляется в присутствии гепарина после удалений из плазмы AT III Протеин С Витамин К-зависимая серин-амидаза, инактивирующая факторы VIIIa и Va; эндогенный активатор плазминогена. Активируется тромбином и комплексом "тромбомодулин-тромбин" Протеин S Витамин К-зависимый кофактор протеина С Тромбомодулин Гликопротеин, фиксированный на цитоплазматической мембране эндотелия. Связывает и инактивирует тромбин, но не ослабляет его активирующего действия на протеин С Ингибитор тканевого пути свертывания (TFPI) Ингибитор комплекса "тканевой фактор-фактор VIIа-фактор Ха-Са++" "Контактные ингибиторы" (фосфолипидный, плацентарный) Нарушают активацию внутреннего механизма свертывания (комплексы факторов XII и XI) Антитромбопластины α 2 -макроглобулин Ингибиторы комплекса факторов III - Vila. Слабый ингибитор тромбина, плазмина, калликреина α 1 -антитрипсин Ингибитор тромбина, факторов IXa, Xla, ХIIа, плазмина Ингибитор комплемента I (Анти-CI) То же Ингибиторы полимеризации фибрин-мономеров Тормозят образование фибрина
Антитромбин III v Референсные значения АТ: 86 - 116% Методы определения: ü метод с хромогенным субстратом. Антитромбин расщепляет субстрат, в результате чего образуется окрашенный продукт, количество которого зависит от исходной активности антитромбина III. Реже используются ü иммунохимические (турбидиметрия, нефелометрия) ü коагуляционные методы. Снижение уровня AT-III (до 40 -50%) является фактором тромбогенного риска
Определение физиологических антикоагулянтов Референсные значения протеина С: 94 -124% Референсные значения протеина S: 81 -111% Активность протеина С следует определять до начала лечения антикоагулянтами непрямого действия и контролировать во время лечения. Время полужизни протеина С в циркуляции 4 - 6 часов, его концентрация при лечении непрямыми антикоагулянтами снижается раньше, чем витамин-Кзависимых факторов свертывания, что может привести к развитию рикошетных тромбозов
Определение протеинов С и S Методы определения протеина С ü с хромогенным субстратом – протеин С расщепляет хромогенный субстрат, в результате чего образуется окрашенный продукт, количество которого зависит от исходной активности протеина С. При лечении непрямыми антикоагулянтами появляются формы протеина С, которые не обладают антикоагулянтной активностью, но определяются методами с хромогенными субстратами , что может привести к завышенным результатам. Реже используются ü коагуляционный метод ü иммунохимический (применяется реже, т. к. данный способ выявляет только классическое снижение концентрации протеина С и не определяет его функциональную неполноценность). Методы определения протеина S ü Иммунохимический (предпочтительно) ü Коагуляционный (редко)
Дефицит протеина С связан с высоким риском развития тромбоза. Недостаточность протеина С может быть двух типов: количественная (тип I) качественная (тип II) – протеин присутствует, но он неактивен или малоактивен.
Тесты для исследования фибринолитической системы
Время лизиса эуглобулиновых сгустков / ХIIа зависимый фибринолиз v Определяют время спонтанного лизиса сгустка, образующегося из эуглобулиновой фракции бестромбоцитной плазмы при добавлении к ней раствора хлорида кальция. Растворение сгустка может быть значительно ускорено предварительным введением в плазму каолина — мощного контактного активатора внутреннего механизма фибринолиза, связанного с активированием комплекса факторов: фактор XIIкалликреин-кининоген (“ХIIа зависимый фибринолиз”). v Референсные значения: XIIа зависимый фибринолиз 4– 10 мин УКОРОЧЕНИЕ ВРЕМЕНИ ЛИЗИСА (активация фибринолиза): уменьшение концентрации фибриногена – гипо- и дисфибриногенемия. УВЕЛИЧЕНИЕ ВРЕМЕНИ ЛИЗИСА (угнетение фибринолиза): гиперфибриногенемия.
Тесты активации свертывания крови
D-димеры v Референсные значения D-димера: 33, 5 -727, 5 нг/мл D-димеры – показатель того, что в процессе фибринолиза расщепляется именно фибрин, а не фибриноген или фибринмономеры. Методы определения D-димеров: иммуноферментным методом с использованием моноклональных антител, Ø иммунодиффузии, Ø методом турбидиметрии, Ø латекс-агглютинации. Ø На содержание D-димеров влияют такие факторы, как величина тромба, время от начала клинических проявлений до назначения антикоагулянтной терапии, прием антикоагулянтов, на фоне которых уровень D-димеров постоянно снижается. Поэтому более важной для исключения диагноза тромбоза является отрицательная диагностическая значимость теста.
Растворимые фибрин-мономерные комплексы (РФМК) Референсные значения: (РФМК по орто-фенантролиновому тесту) - до 4, 0 мг% ПОВЫШЕНИЕ: активация внутрисосудистого свертывания крови (ДВСсиндром, тромбоз глубоких вен, эмболии легочной артерии); возможно при лечении антикоагулянтами; физический и психологический стрессы; нормально протекающая беременность; в период новорожденности .
Тромбоэластография основана на графической регистрации изменений вязкости в фибрин тромбоцитарной структуре крови, происходящей в процессе ее свертывания. кривая зависимости амплитуды колебаний от времени характеризует процесс свертывания крови, а позже фибринолиза метод позволяет качественно и количественно охарактеризовать процесс образования сгустка, его механические характеристики, плотность, стабильность и процесс фибринолиза во времени.
Тромбоэластограмма отражает три фазы свертывания крови: I фаза - R (4 -10 мин) - время реакции (образование тромбокиназы ), характеризуется отрезком прямой от начала записи до расширения в 1 мм; II фаза - К (5 -8 мин) - время образования сгустка (скорость образования тромбина), определяется по расстоянию от расширения кривой в 1 мм до расширения в 20 мм; III фаза - образование фибрина, характеризуется максимальной амплитудой кривой – Ма (46 -66 мм), отражает функциональную способность тромбоцитов, количество и качество фибриногена, взаимодействия фибрина и тромбоцитов в сгустке.
По характеру кривой ТЭГ можно определить состояние гипо-, гипер- и нормокоагуляции, активации фибринолиза. Используя расчетные показатели, можно количественно оценить степень отклонения от нормы. Гиперкоагуляция — укорочение R, К и увеличение Ма. Гипокоагуляция — удлинение R, К и уменьшение Ма. Тромбоэластограмма —очень неточное исследование, обычно используется, чтобы быстро сориентироваться, есть ли у пациента гиперкоагуляция или гипокоагуляция, например, перед операцией. Причин отклонения в свертываемости крови тромбоэластограмма не определяет.
Характер кривой тромбоэластограммы при различных состояниях системы гемостаза
Показания для исследования системы гемостаза определение причин кровоточивости; распознавание причин склонности к тромбофилии; отбор больных группы риска для профилактики кровотечений и тромбоэмболий в послеоперационном (послеродовом) периоде; диагностика ДВС-синдрома при неотложных и критических состояниях; контроль за лечением антикоагулянтами, антиагрегантами, фибринолитиками и препаратами заместительной терапии компонентами крови; решение проблем привычного невынашивания беременности при АФС, тромбофилиях
Лабораторная оценка гемостаза Оценочные тесты 1 - го уровня – лаборатории первичного звена: Количество тромбоцитов, время кровотечения, АЧТВ, ПВ (МНО), фибриноген по Клаусу Время свертывания крови Оценочные тесты 2 -го уровня – лаборатории диагностических центров и стационаров Агрегация тромбоцитов, тромбиновое время, D димер (или РФМК), лизис эуглобулиновых фракций (Хагеман зависимый фибринолиз)
Лабораторная оценка гемостаза Дополнительные тесты – в специализированных лабораториях При кровоточивости Фактор Виллебранда – активность Факторы свертывания – активность При тромбозах Антитромбин III, протеины C и S, а. РСрезистентность Генетический анализ – ф. V-Leiden, мутация гена протромбина Другие тесты - гомоцистеин, волчаночный антикоагулянт, антифосфолипидные антитела Контроль антитромботической терапии – в лабораториях всех уровней Нефракционированный гепарин – АЧТВ Антагонисты витамина К – МНО
ПОДГОТОВКА БОЛЬНОГО И ПРАВИЛА ВЗЯТИЯ МАТЕРИАЛА ДЛЯ АНАЛИЗА
Влияние факторов преаналитического этапа на показатели гемостаза Время суток (в ночное время – снижение факторов свертывания, повышение РАI 1 (ИАП 1) Прием пероральных контрацептивов (повышение активности большинства факторов свертывания, агрегации тромбоцитов, снижение АТ III) Длительный стаз более 3 мин (укорочение АЧТВ, ПВ, ТВ, повышение фибриногена, АТ III, повышение фибринолитической активности) Стресс, физическая нагрузка (повышение фибринолитической активности, укорочение АЧТВ, активация ф. VIII, увеличение ф. Виллебранда) Положение тела (в положении стоя – относительное увеличение содержания факторов свертывания) Алкоголь ( после приема алкоголя уменьшение АТ III, фибриногена, повышение ингибитора активатора фибриногена, уменьшение времени кровотечения; при хроническом алкоголизме – уменьшение количества тромбоцитов, нарушение агрегации) Курение увеличение агрегации тромбоцитов, адгезии, повышение фибриногена, АТ III, повышение РАI 1 (ИАП 1), фибриногена, в тромбоглобулина, снижение ф. VII.
Влияние пищи на показатели гемостаза Жирное мясо уменьшает фибринолитическую активность, бесхолестериновая диета способствует повышению фибринолитической активности крови. Фрукты и зеленые овощи в большом количестве способствуют активации фибринолиза в основном за счет уменьшения ингибитора активатора плазминогена (PAI 1). Рыбная диета в течение нескольких недель сопровождается уменьшением количества и агрегации тромбоцитов (меньшение агрегации тромбоцитов объясняется увеличением в их мембране полиненасыщенных жирных кислот, которыми богата рыба и морепродукты) , а также снижением фибринолиза. Витамин С, витамин Е, лук и чеснок могут вызвать нарушения агрегации тромбоцитов. Витамин К в организме человека частично синтезируется микрофлорой кишечника, частично поступает с пищевыми продуктами. При применении per os антибиотиков широкого спектра могут возникнуть кровотечения из за недостатка витамин К зависимых факторов. Витамин К в больших концентрациях содержится в овощах (шпинате, кабачках), злаках и печени. У больных, принимающих непрямые антикоагулянты, исключительно овощная диета в больших количествах требует дополнительной корректировки антикоагулянтного потенциала крови по ПТ.
Интерферирующие лекарственные препараты Оральные контрацептивы повышают активность большинства факторов плазменного гемостаза, увеличивают агрегацию тромбоцитов и снижают уровень протеина С и протеина S. Они резко увеличивают вероятность тромбозов при наличии наследственных или приобретенных риск факторов тромбофилий. Валъпроиковая кислота (используется в препаратах для лечения эпилепсии) может вызвать тромбоцитопению, уменьшение уровня фибриногена, состояние, имитирующее болезнь Виллеб ранда II типа. Аспарагиназа (препарат для лечения лимфобластных лейкозов) может приводить к снижению фибриногена, уменьшению антитромбина, протеинов С и S, витамин К зависимых факторов, снижению плазминогена. Антибиотики широкого спектра действия вызывают дефицит витамина К в организме за счет подавления активности бактериальной микрофлоры. Анальгетики (НПВС, антиревматоидные, жаропонижающие препараты), содержащие ацетилсалициловую кислоту, влияют на функцию тромбоцитов, т. к. вызывают необратимое ингибирование циклооксигеназы
За 3 дня до исследования исключить тяжелые физические нагрузки Период воздержания от алкоголя не менее 24 ч Материал берется утром (7 9 ч утра) Натощак Отдых не менее 15 мин после даже незначительной нагрузки
Для избежания неверных резульатов капиллярная кровь может использоваться только для некоторых адаптированных методов: подсчет тромбоцитов, определение времени кровотечения, определение протромбинового (ПВ) и активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ). Определение ПВ в капиллярной крови используется в основном для контроля за приемом непрямых антикоагулянтов в амбулаторных и домашних условиях, а также для экспресс диагностики у детей первых месяцев жизни. Определение АЧТВ в капиллярной крови используется исключительно для мониторинга гепаринотерапии.
Портативный прибор «Coagu. Check Plus» (фирма «Roche» ) для определения ПВ и АЧТВ
Техника взятия Венозный стаз не более 1 мин (т. к. происходит освобождение белков из сосудистой стенки, активация тромбоцитов, повышение концентрации факторов свертывания, активация фибринолиза (после 3 мин стаза – укорочение ПВ, АЧТВ, ТВ примерно на 10% 20%, повышение антитромбина, фибриногена и др. факторов свертывания) Силиконированная игла с широким просветом Использование шприца нежелательно (если берется быстро – турбулентное движение крови, если медленно – необратимое свертывание, что сопровождается активацией тромбоцитов, факторов свертывания и их потреблением) Для исследования гемостаза кровь берется во 2 пробирку
Кровь берется из локтевой вены в: Градуированную силиконированную стеклянную или пластиковую пробирку с антикоагулянтом Градуированный пластиковый шприц Моновет –коммерческая аспирационная система Вакутайнер (с голубой крышкой) СТАД пробирки (цитрат натрия+теофиллин, аденозин, дипиридамол для предотвращения активации тромбоцитов) При заборе крови из центрального катетера удалить до 10 мл и затем взять кровь для исследования. Если через этот катетер вводился гепарин, то удаляют до 20 мл крови, но т. к. сохраняется высокая вероятность влияния следов гепарина на АЧТВ, то приоритет должны получать гепарин независимые тесты (ПВ, фибриноген, рептилазное время, фибрин мономеры, антитромбин)
Влияние антикоагулянта на результат Цитрат натрия 109 ммоль (кровь смешать с 3, 8% р ром цитрата натрия в соотношении 9: 1)
Соотношение объема плазмы и раствора цитрата при разном гематокрите
Хранение, доставка Согласно международным рекомендациям срок доставки проб в лабораторию (ARUP Laboratories, 2002) для исследования показателей гемостаза не должен превышать 45 минут после взятия крови у пациента.
НАРУШЕНИЯ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА
Нарушения системы гемостаза Склонность к кровоточивости (геморрагические диатезы) Вазопатии Тромбоцитарные нарушения (Тромбоцитопении и тромбоцитопатии) Коагулопатии Склонность к тромбообразованию (тромбофилии)
Нарушения функции сосудистой стенки Врожденные (врожденная телеангиоэктазия синдром Rendu-Osler-Weber; патология соединительной ткани – синдром Ehlers-Danlos; ангиоматоз сетчатки Hippel-Lindau) Приобретенные (при тромбоцитопении, ревматизме, дефиците витамина С, приеме глюкокортикоидов и др. )
Тромбоцитарные нарушения Тромбоцитопения – уменьшение количества тромбоцитов в крови менее 150 000/мкл Причины тромбоцитопений Физиологические состояния (некоторое снижение во время менструации, беременности). Недостаточность кроветворения (снижение образования тромбоцитов). Повышенная деструкциия тромбоцитов (аутоиммунные; изоиммунные, гаптеновые тромбоцитопении; тромбоцитопении, связанные с вирусной инфекцией; с механическим повреждением тромбоцитов). Секвестрация тромбоцитов (в гемангиоме; в селезенке). Повышение потребления тромбоцитов (синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови; тромботическая тромбоцитопеническая пурпура и др. ) Гепарин-ассоциированная тромбоцитопения (первого типа, возникающая в первые два дня после начала лечения гепарином; второго типа, развивающаяся между 4 и 20 днями после начала гепариногерапии).
Тромбоцитопатии Несостоятельность функций тромбоцитов – адгезии, агрегации, секреции, ретракции тромбоцитарного агрегата
Дифференциальная диагностика нарушений функций тромбоцитов Патология Тромбастения Гланцмана Синдром Сулье Тромбоциты Количеств Размер о Отсутствие ГП IIb-IIIа Недостаточность реакции высвобождения Передозировка аспирина серых N N Отсутствие ГП Ib ↓ гигантские Низкий синтез функционально нормального фактора Виллебранда, количественно нормальный синтез белка с нарушенной функцией Нарушение тромбоцитарной секреции N Нарушенная фаза гемостаза АДФ, адреналин 1 волна 2 волна Агрегация коллаген ристомицин Арахидоно вая кислота Нарушена обратимая агрегация Нарушена адгезия Нарушена Nили нарушена N N Нарушена адгезия N N N Нарушена. Агрегация не корригируетс я при добавлении нормальной плазмы Нарушена. Агрегация корригируетс я при добавлении нормальной плазмы N N Нарушена N Нарушена дефицит пула αгранул N N N Нарушена N Nили нарушена Дополнительные тесты Нарушена N Нарушена необратимая агрегация и секреция N Необратимая инактивация циклоксигеназы Бернара- Болезнь Виллебранда Синдром тромбоцитов Характер дефекта Экспрессия IIb-IIIа ГП N Экспрессия Ib ГП N Определение антигена фактора Виллебранда, снижение активности VIII фактора Прекратить прием аспирина и других НПВС и повторить обследование Снижение плотности и числа гранул хранения
Наиболее значимые лабораторные тесты, используемые для диагностики врожденных нарушений функций тромбоцитов
Коагулопатии Врожденные Приобретенные
Врожденные коагулопатии Гемофилия А – около 70% Гемофилия В – 6 -13% Гемофилия С – 1 -3% Дефицит факторов VII и V – 0, 5 -1, 5% Дефицит фактора X – 0, 3 -0, 5%
Гемофилия А геморрагическая коагулопатия, связанная со снижением активности фактора VIII в крови. Клиническая классификация гемофилии А
Заменная проба на основе АЧТВ дифференциальная диагностика между дефицитом фактора или присутствием ингибитора (волчаночного антикоагулянта) в плазме
Гемофилия В геморрагическая коагулопатия, возникающая вследствие снижения активности фактора IX. Заболевание сцеплено с полом, клинически сходно с гемофилией А. Частота встречаемости приблизительно 1 на 30 000 мальчиков. Классификация по тяжести основана на определении активности фактора IX в крови: тяжелая форма IX а <1%, среднетяжелая IX а 1 5%, легкая форма IX а >5 30%.
Изменения лабораторных показателей при гемофилии В
Болезнь Виллебранда геморрагическое заболевание, являющееся следствием качественных или количественных нарушений фактора Виллебранда. БВ бывает наследственной или приобретенной. Частота носителей дефектного гена v. WF в популяции достигает 1: 100 человек, но лишь 10 30% из них имеют клинические проявления.
БВ подразделяется на 3 типа, а тип 2 на 4 подтипа (классификация Sadler, 1994) • 1 -й тип - наследственное заболевание с частичным дефицитом v. WF в крови и нормальным распределением мультимеров v. WF; • 2 -й тип наследственная патология с качественным изменением v. WF. Второй тип подразделяют на 4 подтипа: подтип 2 А - характеризуется снижением мультимеров v. WF большой и средней молекулярной массы; подтип 2 В - большие мультимеры v. WF снижены, увеличена аффинность к тромбоцитарному гликопротеину 1 Ь и снижена аффинность к другим рецепторным гликопротеинам; подтип 2 М - характеризуется сниженной ристомицин кофакторной активностью при нормальном количественном и качественном составе мультимеров v. WF; подтип 2 N качественные варианты v. WF со значительным снижением аффинности к ф. VIII (снижена v. WF: FVIIIB); • 3 -й тип - практическое отсутствие v. WF в крови.
Клинические особенности и диагностические признаки болезни Виллебранда
Диагностические критерии болезни Виллебранда Типичный геморрагический синдром. Признаки снижения специфической активности v. WF • Для типа 2 В типична положительная реакция агрегации тромбоцитов при использовании в качестве индуктора ристоцетина в низкой концентрации. • •
Изменение коагулограммы при заболеваниях, сопровождающихся геморрагиями
Благодарю за внимание!
Скачать презентацию Методы исследования системы гемостаза Доцент кафедры клинической лабораторной
7adca5d241dd774f43d4da545b6a210e.ppt