Методы исследования Проточная цитометрия Иммунофлуоресцентный анализ

Методы исследования • Проточная цитометрия • Иммунофлуоресцентный анализ

Проточная цитометрия. Принцип метода 1. 2. 3. 4. 5. 6. Поверхностные Аг специфически маркируются антителами, меченными флуорохромом. Взвесь одиночных клеток вводят оптическую систему прибора. Клетки проходят через луч лазера, сфокусированном на потоке и перпендикулярном к нему. Свет отражается и рассеивается клетками Свет возбуждает флуоресценцию флуорохрома. Отраженный свет и эмиссия воспринимается детекторами, которые оснащены линзами и оптическими фильтрами

Маркеры • В-фикоэритрин. белок с • Флуоресцеин. ММ=250 к. Да, выделенный из морских водорослей. Участвует в фотосинтезе. Длина волны возбуждения=488 нм, длина волны испускания=575 нм. Высокий квантовый выход люминесценции. Длина волны испускания близка длине волны возбужднеия аргонового лазера, который используется в цитофлуориметре.

• 7. Возникающие сигналы регистрируются компьютером и • а) преобразуются немедленно • б) сохраняются в памяти • 8. Сортировка клеток на основе этих результатов. • 9. Усиление сигналов и вывод результатов на экран.

Характеристики клеток • 1. Переднее рассеяние. Свет, рассеянный под малым углом. Определение размеров клеток; различает живые и мертвые клетки; эритроциты и ядросодержащие • 2. Боковое рассеяние. Рассеяние под углом 90 о. Определяет структурную гетерогенность по количеству цитоплазматических гранул • 3. Эмиссия флуоресцеина. Линия испускания аргоновых лазеров-488 нм, близка к максимуму возбуждения флуоресцина. • 4. Эмиссия В-фикоэритрина длина волны возбуждения=488 нм, длина волны испускания 575 нм. Высокий квантовый выход. Идеальный флуорохром для проточной цитометрии.

Благодаря схемам электронной компенсации, при соответствующих оптических фильтрах можно разделить эмиссии флуоресцина и фикоэритрина и использовать их одновременно.

Анализ результатов v Простая гистограмма- соотношение частоты и размера клеток (интенсивности флуоресценции) а) линейная ( скрывает частоту тусклых клеток и и гетерогенность флуоресцирующих клеток) б) логарифмическая (предпочтительнее)

v Точечная цитограмма строится по сигналам от двух разных детекторов, каждая клетка дает 1 точку. Положение точки зависит от амплитуды этих сигналов. (Цитограмма «Х -Y» )

v Контурная цитограмма. Выводятся сигналы от двух детекторов, на основе которых строится контурный график. Каждый контур соответствует заранее выбранной частоте клеток данного типа.

v Изометрическое представление данных – контурный график в 3 D. Вносит мало ясности в представление данных.

Иммунофлуоресцентный анализ

Иммунофлуоресценция Метод, основанный на использовании специфичности иммунологической реакции и чувствительности флуоресцентной микроскопии. Постановка пробы и точная локализация иммунной реакции проходит достаточно быстро.

Факторы, влияющие на результаты анализа • 1. Желательная специфическая флуоресценция. Связывание меченных Ат с Аг. • 2. Неспецифическая флуоресценция. Отложение флуоресцирующих конъюгатов на тканевых структурах, например, при избытке красителя; взаимодействии Ат с Fc- рецепторами. Включение метки в др. сывороточные белки, кроме Ig; неспецифическое связывание альбумина, фибронектина; аутофлюоресценция • Нежелательная специфическая флюоресценция Перекрестные реакции, недостаточная специфичность самого конъюгата.

Этапы метода • 1. Получение, характеристика, маркировка антисывороток. • 2. Получение антигенного субстрата. • 3. Обработка флюоресцрующими Ат (анализ) • 4. Микроскопирование.

Маркировка Ig • 1. Получение гамма-глобулиновой фракции (5– кратное переосаждение сульфатом аммония) • 2. Определение реактивности Ат и содержание белка в препарате. • 3. Маркировка ФИТЦ и/или ТРИТЦ. (условия их коньюгирования с Ig одинаковы, а спектр разный) • 4. Инкубация 12 -18 ч при 4 о. С. • 5. Удаление избытка красителя.

Иммунофлуоресцентный анализ Прямой метод H Антигенный субстрат отыскивается с помощью соответствующей антисыворотки. Если антигеном является антитело, то конъюгат будет представлять собой меченое анти-антитело. Непрямой метод • Определение антител(антигенов)в жидкостях либо если нет подходящей меченной антисыворотки. Фиксация комплемента антителами.

Методика • 1. Наносят растворы на препарат ткани так, чтобы он был полностью покрыт жидкостью. • 2. Инкубируют при комнатной температуре 30 мин во влажной камере. • 3. Удаляют праствор отсасыванием. • 4. Отмывают препараты фосфатным буфером

Прямой метод ИФА • 1. Отмывают препарат ФСБ буфером 10 мин. • 2. Инкубируют с различными разведениями конъюгата. • 3. Промывают препарат 30 минтроекратная смена буфера. • 4. Высушивают, заключают в подходящий материал

Непрямой метод ИФА 1. Инкубируют препарат с исследуемым раствором. 2. Отмывают ФСБ 20 мин. 3. Инкубируют с различными разведениями конъюгата. 4. Отмывают ФСБ 30 мин. 5. Высушивают, заключают в подходящий материал.

Определение комплементсвязывающих Ат 1. Инактивируют сыворотку нагреванием до 56 о С 30 мин; отмывка препарата буфером. 2. Инкубируют с сывороткой человека. 3. Отмывка, 2 -кратная смена буфера. 4. Инкубация с Ат к комплементу(С 3), меченным ФИТЦ. 5. Отмывка, 3 -кратная смена буфера.

Двойная флуоресцентная метка • Анализ нескольких Аг в одной ткани. Для этого применяют антисыворотки, меченные несколькими флуорохромами (ФИТЦ, ТРИТЦ). Такая маркировка используется при диагностике лимфом и точного анализа Аг, вызывающих образование ААТ.

Контроль качества ИФА • 1. Контроль собственной флуоресценции. • 2. Контроль конъюгата. Устанавливает собственную флуоресценцию. • 3. Отрицательный контроль. В прямом методе устанавливает неспецифическую флуоресценцию. • 4. Положительный контроль. Устанавливает реакционную способность ткани или конъюгата.

Оценка иммунофлуоресцентных препаратов • Субъективная оценка • Титрование • Микрофотография-микрофлуоримеирия

Тенденции развития метода • 1. Улучшение количественной оценки. Присоединение Аг к твердой фазе(пластик, сефадекс). • 2. Присоединение Ат к флуоресцирующим частицам (липосомам) или промежуточно связывающимся соединениям(биотин). Повышает чувствительность без усиления неспецифических реакций.

Применение ИФА в клинике • Обнаружение аутоантител. АЯФ, АМА. • Преимущества: • • • Простота методики Быстрое выполнение Малый расход реагентов Высокая чувствительность Доступность коммерческих препаратов

Недостатки метода • Нужен большой опыт, чтобы дифференцировать флуоресценцию ААТ в ткани. • Гибкость. Не всегда можно установить наличие искомого Аг или ААТ в флуоресцирующем препарате. • Неточное описание флуоресценции, необходимость сравнения результатов с результатами других лабораторий.

• Данные об ААТ имеют большое значение и в диагностике, и в выборе терапии. Имеет значение только обнаружение ААТ, присущих данной нозологической форме.