Методы исследования мембран Клеточные мембраны отличаются по

Методы исследования мембран

Клеточные мембраны отличаются по составу и функциям

Выделение мембранных фракций 1. Разрушение мембран n Осмотический шок (эритроциты), растирание с кварцевым песком, размельчение гомогенизаторами (животные ткани) n 2. Центрифугирование n Скорость осаждения пропорциональна массе частиц n

Фракция микросом Разрушенные мембраны замыкаются в везикулы. n Смесь везикул разной природы, но с одинаковой плотностью, называется фракцией микросом. n Метод избирательного осаждения – метод дифференциального центрифугирования n

Более тонкое разделение в градиенте плотности сахарозы

Методы разделения и исследования n n n Гель-электрофорез ЭПР, ЯМР ИК-спектроскопия, Дифференциальная сканирующая калориметрия (изучение фазовых переходов), Флуоресцентная спектроскопия, Рассеяние рентгеновского излучения

Электрофорез

Гель-электрофорез Скорость движения молекул зависит от их заряда и размера + Камера с полиакриламидным гелем − Скорость частицы Напряженность поля Заряд молекулы Вязкость геля Радиус частицы z

Гели в электрофорезе

Детектирование в электрофорезе

Двумерный электрофорез (2 D-PAGE)

ЭПР – электронный парамагнитный резонанс Спиновые метки и зонды (см. весенний семестр)

Метод спиновых меток и зондов Спектр ЭПР нитроксильных радикалов состоит, в простейшем случае, из трех линий равной интенсивности, благодаря взаимодействию неспаренного электрона с ядром атома азота, имеющим целочисленный спин ± 1 и 0. CH 2 H 3 C CH 2 C N O. CH 3 Спектр ЭПР и формула нитроксильного радикала (ТЕМРО: 2, 2, 6, 6 tetramethylpiperidine-N-oxide ).

Спиновый зонд TEMPO - это маленькая быстро вращающаяся молекула. n Вращение молекулы зависит от окружающей среды (вязкость, упорядоченность, и т. д. ). n Вид спектра ЭПР TEMPO зависит от скорости и изотропности вращения этой молекулы. n

На основании этого эффекта можно изучать 1. Параметры растворимости зонда в мембранах, n 2. параметры упорядоченности мембран, n 3. вязкость мембран, n 4. ориентацию и положение зонда в мембране, n 5. и др. . . n

Спектр ЭПР ТЕМПО при разных tс Время корреляции– время поворота радикала на 90 ° Время корреляции tc Если нитроксильный радикал находится в водном растворе, то его вращение является изотропным и достаточно быстрым, что приводит к усреднению анизотропии спектра ЭПР. 3. 10 -12 s 3. 10 -11 s DH(+1) 3. 10 -10 s 1. 10 -9 s DH(0) DH(-1) При уменьшении скорости вращения проявляются анизотропные взаимодействия, которые приводят к уширению линий и соответственно изменению амплитуд компонент спектра, а затем и к сдвигу крайних компонент.

Время корреляции нитроксильного радикала непосредственно связано с микровязкостью среды Используя уравнение Стокса-Эйнштейна, можно определить значение вязкости в соответствующей макроскопической системе где R - эффективный радиус нитроксильного радикала. T – абсолютная температура t - время корреляции - вязкость Из уравнения видно, что используя нитроксильный радикал в качестве зонда, можно определить микровязкость среды, в которой находится радикал. В биологических исследованиях этот прием широко используется для измерения микровязкости биологических мембран.

Параметр гидрофобности f a b c a f= a+b a f= c Представленные спектры ЭПР отражают поведение зонда ТЕМПО в средах с различной гидрофобностью. Определив отношения a / (a + b) или (a / c) в этом спектре, можно посчитать параметр гидрофобности f, показывающий сколько и в какой фракции мембраны содержится зонда. Параметр f удобен при изучении процессов перекисного окисления в мембранах.

Плотность упаковки бислоя Производные стеариновой кислоты встраиваются в бислой на разном расстоянии от COOH-группы и ориентируются в поперечном направлении. n Вид спектра зависит от вращательной подвижности метки, и, соответственно, характеризует подвижность жирнокислотных цепей. n

Изменения сигнала ЭПР при удалении нитроксильного радикала от полярной карбоксильной группы жирной кислоты С-5 С-9 С-12 С-16

Спектр ЭПР спинового зонда 5 доксил стеарата в мембране эритроцита 2 A|| При анизотропном вращении стеариновой кислоты вокруг длинной оси сигнал ЭПР будет сильно зависеть от степени анизотропии вращения, который количественно характеризуется так называемым параметром упорядоченности S 2 A┴ Определить параметр упорядоченности S, можно измерив анизотропные константы расщепления – А|| и А┴ и подставив их значения в формулу

Ориентация спинового зонда в липидном бислое m m Z Z Z b a N O X Y

Параметр упорядоченности и вязкость мембраны Параметр упорядоченности S равен 1, если вращение зонда происходит только вокруг нормали к плоскости мембраны. В «замороженных» мембранах, где липиды находятся в кристаллическом состоянии параметр упорядоченности S близок к 1. В «жидких» мембранах отклонение конуса вращения возрастает и S снижается, что вызывает изменения в спектре ЭПР.

Изменения сигнала ЭПР при уменьшении S и возрастании угла отклонения конуса вращения g S=1. 0; g=0 o S=0. 8; g=30. 7 o S=0. 6; g=45. 2 o S=0. 4; g=58. 3 o S=0. 2; g=72. 2 o S=0; g=90 o

Зонды для измерения потенциала на мембране Два зонда: нейтральный и заряженный. n Измеряют их коэффициент распределения «вода/мембрана» n При наличии на мембране заряда, коэффициенты заряженного и незаряженного зонда будут различаться. n

Флуоресцентная спектроскопия Метки и зонды (см. весенний семестр)

Эксимеризация пиренанм) P* P + фотон (370 -390 P + P* (PP)* P + фотон (470 нм) F Флуоресценция мономера Флуоресценция эксимера * Высокая текучесть * Высокая микровязкость 350 400 450 500 nm

Определение толщины слоя – перенос энергии 1. D + hn. Da D* Возбуждение донора 2. D* D + hn. Df Флуоресценция донора 3. D* + A D + A* Перенос энергии 4. A* A + hn. Af Флуоресценция акцептора 3 1 2 4

Флуоресцентные зонды Чувствителен к электрическому полю O– O S Чувствительны к полярности окружения O O CH 3 H C HN 3 O N H C 3 O АНС МБА ДМХ

Расстояние между группами – перенос энергии R 0 А Триптофан R 0

АНС флуоресцирует только в неполярной среде АНС¯ Липосома из нейтральных липидов АНС — в липиде. Флуоресценция яркая. Липосома, заряженная отрицательно АНС — в воде. Флуоресценция слабая.

Флуоресценция АНС Деев и сотр. 1967 „. 20 100 40 60 80 100 200 400 600 800 1000 F (отн. ед. ) 80 60 40 0 Содержание жирных кислот в липосомах (m. M)

Пирен как флуоресцентный зонд Интактный ЛНП 30 F (отн. ед. ) 25 20 15 10 5 Пирен 360 Окисленный ЛНП 380 400 Длина волны, нм 420

Спектры флуоресценции пирена F Вода 8 Липосомы 4 0 Гептан + 0, 5% этанол Этанол F 4 0 350 400 450 500 нм

Дифференциальная сканирующая калориметрия

Фазовые переходы сопровождаются поглощением или выделением тепла. Эти изменения отражают молекулярную реорганизацию. Энергия фазового перехода = регистрируемое изменение энергии – собственная теплоемкость

Принцип ДСК Измерение тепла, необходимого для увеличения температуры объекта на малую величину. n Современные микрокалориметры измеряют фазовые переходы в малых порциях материала. n

Техника ДСК DSC 1 Mettler Toledo

Кривые теплоемкости и плавления ДПЛ Измерено методом дифференциаль ной сканирующей микрокалориметрии (ДСК)

Было обнаружено. . . 1. В бислоях индивидуальных ФЛ интервал фазовых переходов составляет 1 – 2 градуса и даже меньше. n 2. На Ткр влияет длина жирнокислотных цепей (чем длиннее цепи, тем выше температура перехода) и степень гидратации. n

3. Наличие предперехода при нагревании образца (связан с перестройками полярных головок). n 4. Термограмма нагревания мембранных липидов отличается от термограммы охлаждения (гистерезис липидных систем). Объясняется недостижением равновесных условий при измерении температуры. n

n 5. В нативных мембранах высокое содержание холестерина (плазматические мембраны) не позволяет четко зафиксировать фазовые переходы. Внутриклеточные мембраны оказываются «жидкими» в широком интервале температур (5 – 60 градусов).

Малоугловое рассеяние рентгеновского излучения

МУР нейтронов, SANS (small angle neutron scattering), SAXS (small angle Xray scattering) n Малоугловое рассеяние нейтронов или рентгеновского излучения предоставляет информацию о характере упаковки бислоя и в комбинации с дифференциальной сканирующей калориметрией дает хорошее описание физики фазовых переходов для относительно простых систем.

Принцип МУР (график Гинье) Отклонение луча от горизонтальной плоскости (высота m), расстояние между образцом и детектором и угол рассеяния характеризуют геометрию рассеяния.

Определение структуры осадка комплекса цитохром с/кардиолипин методом малоуглового рентгеновского рассеяния при различных р. Н 105 Å lg(I), отн. ед. цитохром с/ кардиолипин 70 Å 105 Å цитохром с/ кардиолипин 70 Å р. Н 3, 7 р. Н 7, 4 s, нм-1 Кривые малоуглового рассеяния осадков комплекса цитохром с/кардиолипин полученных при р. Н 7, 4 и р. Н 3, 7. Цифрами над чертами указаны межплоскостное расстояние в микрокристалла.