Методы иммунодиагностики Оценка иммунного статуса Реакция преципитации

Методы иммунодиагностики. Оценка иммунного статуса.

Реакция преципитации Классический пример взаимодействия антиген-антитело in vitro - это реакция преципитации. Для ее получения антиген в возрастающих концентрациях добавляют к раствору антител. Количество осаждающихся иммунных комплексов вначале возрастает, а затем падает. Таким образом, кривая преципитации имеет три зоны. • Зона избытка антител: количества антигена недостаточно для того, чтобы в реакцию вступили все антитела; в супернатанте определяются свободные антитела. • Зона эквивалентности: количества антигена достаточно для связывания и осаждения всех имеющихся антител; свободные антигены и антитела в супернатанте отсутствуют. • Зона избытка антигена: количество антигена превышает необходимое для связывания всех антител, что ведет к снижению содержания антител в преципитате.

Реакция преципитации. Двойная иммунодиффузия Для проведения двойной иммунодиффузии агаровый гель наливают на предметные стекла, после застывания вырезают в нем лунки и заполняют их исследуемыми растворами антигена (Аг) и антител (Ат). Растворы диффундируют в гель, и на той линии, где происходит взаимодействие Аг и Ат (с перекрестным связыванием и осаждением иммунных комплексов), образуется линия (дуга) преципитации. При этом возможны три основных типа результатов. 1) Дуги преципитации сливаются: это показывает, что антитела взаимодействуют с идентичными эпитопами на разных антигенах. 2) Антитела выявляют 3 разных эпитопа антигенов, которые образуют независимые дуги преципитации. 3) Формируется «шпора» , указывающая на лишь частичную идентичность эпитопов двух разных антигенов.

Реакция преципитации. Иммуноэлектрофорез Некоторые смеси антигенов слишком сложны для идентификации просто путем диффузии и преципитации, и для анализа таких смесей был разработан метод иммуноэлектрофореза – прежде чем выявлять антигены визуально в реакции преципитации, их разделяют по заряду с помощью этого метода. 1) Разделение осуществляют в агаровом геле, помещенном в электрическое поле, причем р. Н геля устанавливают так, чтобы положительно заряженные белки перемещались к катоду, а отрицательно заряженные - к аноду. 2) Затем между лунками вырезают канавку, которую заполняют раствором антител, диффундирующих в гель. 3) Антигены и антитела формируют дуги преципитации, регистрируемые визуально.

Реакция преципитации. Радиальная иммунодиффузия Методы, основанные на диффузии в геле, попозволяют определять антигены и антитела лишь качественно, количественную же оценку реагирующих компонентов проводят методом простой радиальной иммунодиффузии. В агаровый гель добавляют антитела (Ат), затем наливают его на предметные стекла и оставляют для застывания. В застывшем геле вырезают лунки и вносят в них стандартный объем различных по концентрации растворов антигена. Стекла оставляют не менее чем на 24 ч. В течение этого времени антиген диффундирует в гель и образует с антителами растворимые комплексы (при избытке антигена). Комплексы продолжают диффундировать, связывая все больше антител, пока не будет достигнута зона эквивалентности и не произойдет осаждение комплексов с образованием кольца преципитации. По радиусу зоны, ограниченной кольцом преципитации, определяют ее площадь. Величина площади пропорциональна концентрации антигена, которую вычисляют с помощью калибровочной кривой. Для определения концентрации антител приприменяют тот же метод, но в обратной постановке.

Реакция преципитации. Встречный и ракетный электрофорез Иммунодиффузию в электрическом поле можно производить с одновременным встречным движением антигенов и антител в электрическом поле, приводящим к образованию преципитата – этот способ назван встречным электрофорезом. Принцип метода тот же самый, что и при двойной иммунодиффузии, однако чувствительность выше в 10 - 20 раз. Аналогичная электрофоретическая модификация простой радиальной иммунодиффузии получила название ракетный электрофорез. Ракетный электрофорез позволяет количественно определять антиген в антителосодержащем геле. Линия преципитации очерчивает область в виде ракеты, длина которой пропорциональна концентрации антигена. Определить эту концентрацию можно по калибровочной кривой. Ракетный электрофорез проводят и в обратной постановке, если требуется определить концентрацию антител.

Реакция агглютинации. Если антитела присутствуют в столь низких концентрациях, что их не удается обнаружить и количественно определить при помощи встречного и ракетного электрофореза, применяют реакцию агглютинации. Она основана на способности антител перекрестно связываться с какими-либо крупными объектами (эритроцитами, частицами латекса), взаимодействуя с антигенами нанесенными (или предсуществующими) на их поверхности. Например, можно использовать эритроциты нагруженные каким-либо антигеном и реакция в этом случае будет называться соответственно гемагглютинацией. В каждую лунку вносят суспензию эритроцитов до концентрации клеток 1 %. Если количество антител в лунке достаточно для агглютинации всех эритроцитов, они осаждаются на дно лунки, образуя пятно ( «зонтик» ). Если же антител недостаточно, клетки, скатываясь по стенкам лунки на дно, образуют небольшую плотную «пуговку» . Для выявления плохо агглютинирующих антител ставят реакцию непрямой агглютинации добавляя вторичные агглютинирующие антитела.

Реакция связывания комплемента. Реакция антиген-антитело ведет к образованию иммунных комплексов, которые связывают комплемент при его активации по классическому пути, и на этом основан один из количественных методов определения антигенов и антител. 1. Разведения исследуемой сыворотки, разливают по пробиркам (или вносят в лунки планшета) и в каждую добавляют фиксированное количество антигена. Если сыворотка содержит антитела, образуются иммунные комплексы. 2. К смеси добавляют комплемент. Если комплексы присутствуют, они связывают комплемент и «потребляют» его. 3. В смесь вносят индикаторные клетки (эритроциты) вместе с субагглютинирующим количеством антиэритроцитарных антител. Если в смеси осталось какоето количество комплемента, клетки будут лизированы; если же комплемент связан иммунными комплексами на этапе 2, его не хватит для лизиса эритроцитов.

Реакция иммунофлуоресценции. ПИФ, НИФ Иммунофлуоресцентные методы широко используются для обнаружения аутоантител и антител к тканевым и клеточным антигенам. Прямой иммунофлуоресцентный метод. Раствор антител, меченных флуоресцентным красителем, наносят на препарат; инкубируют, после чего отмывают от избытка антител. Затем связавшиеся антитела выявляют при помощи флуоресцентного микроскопа. Пучок УФ-лучей, направленный на препарат через объектив, позволяет видеть темное поле со светящимися участками, где локализованы связанные антитела. Непрямой иммунофлуоресцентный метод. Раствор немеченных антител наносят на препарат, а затем выявляют их при помощи меченных флуорохромом антииммуноглобулиновых антител.

Реакция иммунофлуоресценции. Проточная цитометрия C помощью иммунофлуоресценции можно идентифицировать отдельные клетки в клеточной суспензии, т. е. выявлять антигены на поверхности живых клеток. Для этой цели используется проточная цитометрия. Клетки в исследуемом образце окрашивают специфическими флуоресцентными реагентами (антителами) для определения поверхностных молекул и вносят в проточную камеру прибора. Выходящие из камеры клетки попадают в поток несущего буферного раствора, затем проходят через лазерный луч, и с помощью детекторов определяются размеры и гранулярность каждой клетки, а также цвет флуоресценции соответствующий разным поверхностным маркерам. На трехмерной диаграмме показаны размеры (s), число (п) и флуоресценция (f) лимфоцитов цельной клеточной популяции и популяции CD 8+.

Твердофазный иммуноанализ. ИФА, ИФЛА, РИА Методы этой категории отличаются очень высокой чувствительностью и экономичностью в расходовании реагентов. Для обнаружения антигенов или антител в этих методах применяются лиганды, меченые радиоизотопами (РИА), ферментами (ИФА) или флуорофорами (ИФЛА). Наиболее распространенным твердофазным методом является иммуноферментный анализ (ИФА). В этой системе лигандом служит молекула, ковалентно связанная с ферментом, например пероксидазой. Лиганд соединяется с тестируемыми антителами или антигеном, и после предварительного удаления несвязавшегося лиганда отмыванием, связанный лиганд можно визуализировать путем добавления хромогена - бесцветного субстрата, который под влиянием связанного с лигандом фермента превращается в окрашенный продукт реакции. Количество тестируемых антител или антигенов определяют по оптической плотности окрашенного продукта реакции с помощью спектрофотометра.

Иммуноблоттинг При проведении иммуноблоттинга сложную смесь антигенов вначале подвергают гель-электрофорезу, а затем фракционированные пептиды переносят (блоттинг) на лист нитроцеллюлозы для идентификации индивидуальных антигенов при помощи специфических антисывороток и меченых радиоизотопами антител. Принцип подобен тому, который используется в РИА или ИФА. После повторного отмывания лист нитроцеллюлозы помещают в кассету с рентгеновской пленкой; на проявленной пленке видны полосы локализации антигена, связавшего меченые антитела. Метод можно модифицировать, используя хемилюминесцентную метку или конъюгат антител с ферментом, выявляющий связанный материал при нанесении непосредственно на нитроцеллюлозный лист вместе с хромогеном.

Определение активности системы комплемента Наиболее простой способ измерения активности комплемента состоит в определении концентрации сыворотки, вызывающей гемолиз 50 % клеток в стандартном препарате эритроцитов, сенсенсибилизированных антигеном. Данный метод позволяет определять общую активность компонентов С 1 – С 9, однако если в сыворотке обнаружен дефицит комплемента, этим методом невозможно установить, отсутствием какого компонента дефицит обусловлен. Для этого существуют методы определения различных отдельных компонентов комплемента по их содержанию или функциональной активности. Содержание (уровень) индивидуальных белков комплемента обычно определяют при помощи РИА или ИФА, используя антитела, специфичные к конкретному белку. Для измерения функциональной активности в суспензию сенсибилизированных эритроцитов вносят все компоненты комплемента, необходимые для лизиса, за исключением исследуемого белка

Определение активности клеток иммуной системы. Антителообразующие клетки В-лимфоциты, продуцирующие Ig. M- или Ig. G-антитела, можно определить при помощи метода локального гемолиза, или реакции бляшкообразования. К исследуемой клеточной популяции добавляют эритроциты, сенсибилизированные антигеном. При последующей инкубации эритроциты, окружающие антителообразующую клетку, связывают секретируемые ею специфические антитела и в результате лизируются комплементом. Локальный гемолиз может быть двух типов. Прямой локальный гемолиз: антигенспецифичные lg. M-антитела, продуцируемые антителообразующей клеткой, способны непосредственно вызывать комплементзависимый гемолиз, поскольку эти антитела обладают высокой комплементсвязывающей активностью. Непрямой локальный гемолиз: антигенспецифичные lg. G-антитела связывают комплемент не столь эффективно, и чтобы усилить способность lg. G-продуцирующих клеток лизировать эритроциты-мишени, требуется добавление антител анти-lg. G.

Определение активности клеток иммуной системы. Антителообразующие клетки Для определения отдельных В-лимфоцитов, продуцирующих специфические антитела применяют метод ELISPOT – иммуноферментный тест с локальным связыванием. Чтобы выявить антителообразующие клетки, лимфоциты наносят на сенсибилизированную антигеном подложку. Секретируемые специфические антитела связываются с антигеном в непосредственной близости к продуцирующей их клетке. Места связывания (пятнышки - англ. spots) выявляют с помощью конъюгированных с ферментом антител анти-lg и хромогена.

Определение активности клеток иммуной системы. Синтез цитокинов Для определения функционально активных Тлимфоцитов, секретируюшие те или иные растворимые медиаторы, т. е. цитокины также можно использовать метод ELISPOT. Определение проводят на подложке с иммобилизованными антителами к специфическому цитокину (например, анти-ИФН). Антитела связывают данный цитокин, выделяемый Т-клеткой в окружающую зону, и этот эффект связывания можно выявить путем соответствующей обработки подложки при помощи конъюгированных с ферферментом антител к другому эпитопу цитокина. В результате вокруг цитокин-выделяющих Т-клеток будут видны окрашенные пятнышки.

Определение активности клеток иммуной системы. Пролиферативная активность (РБТЛ) При постановке реакции бласттранформации лимфоцитов (РБТЛ) их предварительно выделяют из цельной крови. Полученные клетки отмывают от загрязнений (включая антигены) и переносят в тест-пробирки со средой для культивирования, содержащей антиген или неспецифический митоген. За 16 ч до сбора клеток в культуру добавляют 3 Нтимидин. Собирают клетки на фильтре и измеряют радиоактивность на жидкостном сцинтилляционном счетчике. Высокий уровень радиоактивности свидетельствует о том, что клетки пролиферируют, т. е. отвечают на данный антиген или неспецифический митоген. Существуют также другие методы, позволяющие оценить ответ лимфоцитов на стимулирующие сигналы – например, оценка изменения метаболической активности по потреблению глюкозы, постановка смешанной культуры лимфоцитов (СКЛ) и др.

Определение активности клеток иммуной системы. Цитотоксическая активность Для определения цитотоксичности эффекторных клеток, предварительно инкубируют клетки-мишени с изотопом 51 Сr, который проникает внутрь клеток и связывается с белками. По окончании инкубации удаляют свободный 51 Сr отмыванием, вносят клетки-мишени в лунки планшета и культивируют совместно с эффекторными клетками в течение 4 -16 ч, после чего определяют в культуральной жидкости количество хрома, вышедшего в среду в результате лизирования клеток-мишеней эффекторными клетками. Также для определения активности цитотоксических эффекторных клеток можно также использовать гемолитические системы с эритроцитами, предварительно обработанными сенсибилизирующим их антигеном.

Определение активности клеток иммуной системы. Фагоцитоз Существуют методы, позволяющие оценить все стадии фагоцитоза – от хемотаксиса, до завершенности (эффективности) фагоцитоза. Чаще всего фагоцитарная активность оценивается по поглощению корпускулярных антигенов – бактерий, дрожжей, частиц латекса и т. п. После инкубации фагоцитов с антигеном готовятся мазки, которые окрашивают и микроскопируют. Определяют фагоцитарный индекс (% фагоцитов с поглощенным антигеном), фагоцитарное число (среднее число фагоцитированных частиц на один фагоцит) и завершенность фагоцитоза (число колоний микроорганизмов выросших из лизата фагоцитов на твердой питательной среде). Также оценивается бактерицидная активность фагоцитов в тесте с нитросиним тетразолием (НСТ-тест). Определяется % клеток, вступивших в реакцию в базовых и стимулированных условиях и вычисляется индекс активации фагоцитов для этих же условий.

Иммунный статус – состояние иммунной системы человека, оцениваемое комплексом качественных и количественных клинико-лабораторных показателей. Следует различать антигенспецифический и антигеннеспецифический иммунный статус. Причины необходимости оценки иммунного статуса: • Снижение параметров иммунного ответа (первичные и вторичные иммунодефицитные состояния). • Изменение типа ответа иммунной системы (аллергия, аутоиммунный, лимфопролиферативный ответ, травма, персистирующие инфекции, длительная антибиотикотерапия, гормонотерапия; онкопатология и др. ) • Подбор иммуномодуляторов in vitro. • Проведение и контроль иммунокоррекции (коррекция измененных параметров, коррекция неизмененных параметров) Совокупность методов для оценки иммунного статуса принято (условно) делить на уровни. Чаще всего выделяют два уровня: 1) ориентировочные, наиболее общие ( «грубые» ) методы, простые в исполнении; 2) аналитические, высокоспецифичные и трудоемкие методы. Можно также выделить третий уровень: 3) молекулярно-генетические методы.

Оценка Т-лимоцитарного звена 1. Определение общего числа лимфоцитов. 2. Определение абсолютного и относительного числа зрелых Тлимфоцитов (CD 3+) и их субпопуляций – Тх (CD 4+) и Тц (CD 8+). 3. Определение соотношения CD 4+CD 8+ (иммунорегуляторный индекс, ИРИ). 4. Определение абсолютного и относительного числа лимфоцитов в субпопуляциях Тх1, Тх2, Тц1, Тц2 и пр. 5. Определение реакции Т-лимфоцитов на активацию фитогемагглютинином (Т-митоген) в реакции бластной трансформации (РБТЛ). 6. Определение маркеров ранней активации CD 25, HLA-DR, CD 71 на Тлимфоцитах. 7. Исследование продукции цитокинов (ИФН-γ, ИЛ-2, -4, -6, ФНО и пр. ). 8. Постановка кожных проб ГЗТ. 9. Определение пролиферативного ответа на специфический антиген в РБТЛ. 10. Определение цитотоксической активности на специфический антиген. 11. Определение уровня апоптоза Т-лимфоцитов (CD 95+). 12. Выявление генетических дефектов ферментных систем, рецепторного аппарата, цитоскелета и т. п.

Оценка В-лимоцитарного звена 1. Определение общего числа лимфоцитов. 2. Определение абсолютного и относительного числа зрелых Влимфоцитов (CD 19+, 20+, 21+, 22+, СD 72). 3. Определение количества неспецифических иммуноглобулинов классов Ig A, s. Ig. A, Ig. М, Ig. G, Ig. Е. 4. Определение количества специфических иммуноглобулинов классов Ig A, s. Ig. A, Ig. М, Ig. G, Ig. Е. 5. Определение циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК). 6. Определение абсолютного и относительного числа лимфоцитов в субпопуляциях В 1, В 2. 7. Определение количества неспецифических иммуноглобулинов подклассов Ig A 1, 2; Ig. G 1, 2, 3, 4. 8. Определение количества специфических иммуноглобулинов подклассов Ig A 1, 2; Ig. G 1, 2, 3, 4. 9. Определение активности антителообразующих клеток. 10. Определение пролиферативного ответа на неспецифический антиген в РБТЛ. 11. Определение пролиферативного ответа на специфический антиген в РБТЛ. 12. Выявление генетических дефектов ферментных систем, рецепторного аппарата, цитоскелета и т. п.

Оценка неспецифического клеточного звена 1. Определение абсолютного и относительного числа NK-лимфоцитов (CD 16+, 56+). 2. Определение абсолютного и относительного числа клеток гранулоцитарно-макрофагального звена (CD 11+, 14+, 18+ и пр. ). 3. Определение фагоцитарного числа (ФЧ) и фагоцитарного индекса (ФИ) нейтрофилов. 4. Определение бактерицидной активности по индексу активации нейтрофилов в базовых и стимулированных условиях в НСТ-тесте. 5. Определение завершенности фагоцитоза. 6. Определение хемотаксиса, адгезии фагоцитов. 7. Определение синтеза цитокинов клетками неспецифического звена. 8. Определение рецепторов к белкам системы комплемента, антителам. 9. Выявление генетических дефектов ферментных систем, рецепторного аппарата, цитоскелета и т. п.

Оценка неспецифического гуморального звена 1. Определение концентрации белков системы комплемента С 1 q, C 1 s, С 2, С 3, С 4, С 5, С 6, С 7, С 8, С 9, пропердина, фактора В, С 1 -ингибитора. 2. Определение концентрации факторов активации системы комплемента С 3 а, С 5 а и др. 3. Определение литической активности комплемента (СН 50, СН 100) в гемолитической системе. 4. Определение отложения комплемента с иммунными комплексами в тканях. 5. Определение комплементсвязывающих рецепторов на лейкоцитах CR 1, CR 2, CR 3. 6. Выявление генетических дефектов в генах кодирующих белки системы комплемента, кофакторы, и ингибиторы.