Методы иммуноанализа Методы иммуноанализа методы детекции

Методы иммуноанализа

►Методы иммуноанализа – методы детекции различных веществ (микробных Аг, аллергенов, гормонов, ферментов и др. ) с помощью специфических Ат

Реакция агглютинации (РА) ► РА - склеивание частиц (бактерий), содержащих Аг, соответствующими Ат в присутствии электролитов (натрия хлорида) ► РА проявляется в виде хлопьев или осадка, состоящих из комплекса Аг-Ат ► РА используют для: ► Определения м/о, серотипов м/о ► Определения антител возбудителя в сыворотке крови больного

Реакция агглютинации

Определение возбудителя ► РА на стекле ► К капле агглютинирующей сыворотки добавляют взвесь бактерии, выделенных от больного ► Образуется хлопьевидный осадок

Развернутая РА в пробирках ► 1. К разведениям сыворотки добавляют взвесь бактерий ► 2. Агглютинация с О-Аг (бактерии, убитые нагреванием) - в виде мелкозернистой агглютинации ► 3. С К и Н -Аг - крупнохлопчатая и протекает быстрее

Определение титра антител в сыворотке крови в РА ►К разведениям сыворотки больного добавляют у/п микроорганизм, выделенный от больного ►Выявляют титр антител и нарастания титра АТ

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА, РПГА) ► Эритроциты (или частицы латекса) с адсорбированными на них Аг взаимодействуют с соответствующими Ат сыворотки, что вызывает склеивание и выпадение эритроцитов на дно осадка

► РПГА ставят в пластиковых планшетках или в пробирках с разведениями сыворотки больного, к которым добавляют эритроцитарный диагностикум ► При отрицательной реакции эритроциты оседают в виде пуговки

РОПГА ►При обнаружении Аг реакцию пассивной гемагглютинации называют обратной - РОПГА

► Ат эритроцитарный диагностикум - эритроциты, на которых адсорбированы антитела ► Обнаружение токсинов и микроорганизмов в сыворотке

Реакция коагглютинации (РКА) ►РКА применяют для определения Аг с помощью Ат, адсорбированных на белке А клеток стафилококка (антительный диагностикум)

►Белок А стафилококка имеет сродство к Fc-фрагменту иммуноглобулинов ►Стафилококки, обработанные диагностической сывороткой адсорбируют Ат сыворотки

►В результате коагглютинации образуются крупные хлопья, состоящие из стафилококков, антител диагностической сыворотки и определяемого микроба

Реакция преципитации (РП) ►РП (от лат praecipilo осаждать) - это формирование комплекса растворимого Аг с Ат в виде помутнения - преципитата ►Комплекс образуется при смешивании Аг и Ат в эквивалентных количествах, избыток одного из них снижает уровень образования иммунного комплекса

► Реакцию преципитации ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, питательных средах и др. ► Широкое распространение получили разновидности реакции преципитации в полужидком геле агара или агарозы, двойная иммунодиффузия по Оухтерлони, радиапьная иммунодиффузия, иммуноэпектрофорез и др.

Реакция кольцепреципитации

Реакция двойной иммунодиффузии по Оухтерлони ► Растопленный агаровый гель тонким слоем выливают на стеклянную пластинку и после застывания в нем вырезают лунки ► В лунки геля раздельно помещают Аг и иммунные сыворотки (Ат), которые диффундируют навстречу другу ► В месте встречи в эквивалентных соотношениях они образуют преципитат в виде белой полосы. У многокомпонентных систем между лунками с антигенами и антителами появляется несколько линий преципитата; у идентичных АГ линии преципитата сливаются; у неидентичных АГ – пересекаются

РП в геле (Б)

Реакция радиальной иммунодиффузии ► Реакцию используют для определения в сыворотке крови иммуноглобулинов различных классов, компонентов системы комплемента и др. ► Иммунную сыворотку с расплавленным агаровым гелем наливают на стекло ► После застывания в геле делают лунки, в которые помещают антиген в различных разведениях

► Антиген, диффундируя в гель, образует с антителами кольцевые зоны преципитации вокруг лунок ► Диаметр кольца преципитации пропорционален концентрации антигена

Иммуноэлектрофорез ► Сочетание метода электрофореза и иммунопреципитации ►Смесь антигенов вносится в лунки геля и разделяется в геле с помощью электрофореза

► Затем в канавку параллельно зонам электрофореза вносят иммунную сыворотку, Ат которой диффундируют в гель и образуют в месте "встречи" с антигеном линии преципитации

Реакция нейтрализации (РН) ► Ат иммунной сыворотки способны нейтрализовать повреждающее действие м/о или токсинов, что связано с блокадой микробных Аг антителами, т. е. нейтрализацией

►РН проводят путем введения смеси Аг (искомый) + Ат (иммунная сыворотка) животным или в культуру клеток, эмбрионы ►При отсутствии повреждающего действия говорят о нейтрализующем действии, следовательно, о специфичности взаимодействия комплекса Аг - Ат

Реакция связывания комплемента (РСК) ►При соответствии другу Аг и Ат они образуют иммунный комплекс, к которому через Fcфрагмент антител присоединяется комплемент (связывание С комплексом Аг-Ат) ►Если же комплекс Аг - Ат не образуется, то С остается свободным

►PCK проводят в две фазы: ► 1 -я фаза - инкубация смеси, содержащей Аг + Ат + комплемент ► 2 -я фаза (индикаторная) - выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, содержащей Ат к эритроцитам б.

► В 1 -й фазе при образовании комплекса Аг-Ат происходит связывание им комплемента ► Во 2 -й фазе гемолиз сенсибилизирован ных Ат эритроцитов не произойдет ►Реакция положительная

► Если Аг и Ат не соответствуют другу (в исследуемом образце нет Аг или Ат) комплемент остается свободным ► Во 2 -й фазе С присоединится к комплексу эритроцит - антиэритроцитарное Ат, вызывая гемолиз ►Реакция отрицательная

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) ►Различают: ►Прямую РИФ ►Непрямую РИФ

Прямой метод РИФ ► АГ тканей, клетки или м/о, обработанные иммунными сыворотками с Ат, меченными флюорохромами, светятся в УФ-лучах люминесцентного микроскопа ► Бактерии светятся по периферии клетки

Непрямой метод РИФ ► Заключается в выявлении комплекса Аг – Ат с помощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом

► Для этого мазки из взвеси микробов обрабатывают антителами антимикробной диагностической сыворотки ► Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах Ат выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой сывороткой, меченной флюорохромами ► В результате образуется комплекс микроб + антимикробные АТ + антиглобулиновые Ат, меченные флюорохромом ► Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и прямом методе

Иммуноферментный анализ (ИФА) ► Выявление Аг с помощью соответствующих им Ат, конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой хрена, бетагалактозидазной или щелочной фосфатазой) ► ИФА применяют для диагностики вирусных, бактериальных, паразитарных болезней, определения гормонов, ферментов, лекарственных препаратов и других биологически активных веществ, содержащихся в исследуемом материале в минорных концентрациях

Принцип метода ИФА ►После соединения Аг с меченой ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат/хромоген ►Субстрат расщепляется ферментом и изменяется цвет продукта реакции ►Интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул Аг и Ат

Твердофазный ИФА ► Вариант теста, когда один из компонентов иммунной -реакции (антиген или антитело ) сорбирован на твердом носителе, напр. , в лунках планшеток из полистирола.

► Компоненты выявляют добавлением меченых антител или антигенов ► После добавления очередного компонента из лунок удаляют не связавшиеся реагенты путем промывания. I. При определении Ат в лунки планшеток с сорбированным Аг последовательно добавляют сыворотку крови больного, антиглобулиновую сыворотку, меченную ферментом и субстрат/хромоген для фермента II. При определении Аг в лунки с сорбированными Ат вносят Аг (напр. , сыворотку крови с искомым Аг), добавляют диагностическую сыворотку против него и вторичные Ат (против диагностической сыворотки), меченные ферментом, а затем субстрат/хромоген для фермента

► Определение Ат в сыворотке больного (в лунках планшеток с сорбированным антигеном)

Определение Аг в сыворотке больного ► (в лунках планшеток с сорбированным и диагностически ми Ат) ►

Конкурентный ИФА для определения Аг: искомый антиген(1) и меченый ферментом антиген(2) конкурируют друг с другом за антитела (3), сорбированные на твердой фазе. ► Конкурентный ИФА для определения антител: искомые антитела и меченые ферментом антитела конкурируют друг с другом за антигены, сорбированные на твердой фазе. ►

Иммуноблоттинг (ИБ) ► Высокочувствительный метод выявления нескольких Аг одновременно, основанный на сочетании электрофореза и ИФА ► Антигены возбудителя разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, затем переносят их из геля на активированную бумагу (1) или нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА.

► (Блоттинг - от англ, blot, пятно) ► Выпускают полоски с "блотами" Аг определенного возбудителя. На эти полоски наносят сыворотку больного (2) ► Затем, после инкубации, отмывают от несвязавшихся Ат и наносят сыворотку против иммуноглобулинов человека, меченную ферментом (3) ► Образовавшийся на полоске комплекс [Аг + Ат больного + Ат против Ig человека] выявляют добавлением хромогенного субстрата (4), изменяющего окраску под действием фермента

Радиоиммунный метод, или анализ (РИА) ► Высокочувствительный метод, основанный на реакции Аг+Ат с применением антигенов или антител, меченных радионуклидом (125 J, 14 C, 3 Н, 51 Сr и др. ) ► После их взаимодействия отделяют образовавшийся радиоактивный иммунный комплекс и определяют его радиоактивность в соответствующем счетчике (бета- или гаммаизлучение) ► Интенсивность излучения прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул Аг и Ат

Конкурентный РИА ►Наибольшее распространение получил метод конкуренции за специфические Ат меченного радиоактивным изотопом Аг и такого же антигена, но свободного от радиоактивной метки, количество которого необходимо определить в исследуемой биологической среде

► С этой целью в исследуемую жидкость, в которой предполагается наличие Аг, добавляют известное количество такого же меченного Аг и стандартное количество антисыворотки с соответствующими Ат ► Если в исследуемой жидкости отсутствует искомый специфический антиген, то около 70– 80% меченного антигена связывается с антителами, обусловливая высокую радиоактивность образующегося преципитата

►Если же искомый Аг присутствует, он конкурирует с меченным Аг и связывает часть Ат ►В результате радиоактивность преципитата падает по сравнению с контролем ►На этом принципе основано количественное определение гормонов, белков сыворотки и др.

Иммунохроматографический анализ (ИХА) ► Метод, основанный на разделении частиц методом парной связки и реакции между Аг и соответствующим ему Ат в биологических материалах (моча, слюна, цельная кровь, сыворотка или плазма крови и т. п. ). ► Проводится с помощью специальных экспресс-тестов, тест-полосок или тесткассет.

► При погружении теста в физиологическую жидкость она начинает мигрировать вдоль полоски по принципу тонкослойной хроматографии ► Вместе с жидкостью движется жидкая фаза тест полоски содержащая Ат с красителем ► Если в этой жидкости присутствует исследуемый Аг (гормон, онкологический или инфекционный маркер), то происходит его связывание, как с первым типом Ат, так и со вторым. При этом происходит накопление Ат с красителем вокруг антител, жестко иммобилизованных в тест-зоне ИХА-полоски, что проявляется в виде яркой темной полосы

► Несвязавшиеся антитела с красителем мигрируют далее вдоль полоски и неизбежно взаимодействуют со вторичными антителами в контрольной зоне, где и наблюдается вторая темная полоса ► Взаимодействие (и темная полоса) в контрольной зоне должны проявляться всегда (если анализ проведен правильно), независимо от присутствия исследуемого антигена в физиологической жидкости