Методы гельминтологических исследований посмертная диагностика гельминтозов l

Методы гельминтологических исследований

посмертная диагностика гельминтозов l l Методы посмертной диагностики гельминтозов. Посмертная диагностика гельминтозов заключается в обнаружении гельминтов на различных стадиях их развития в организме животного. Гельминты паразитируют во всех органах и тканях. Наиболее совершенная методика гельминтологических вскрытий разработана академиком К. И. Скрябиным. Различают полное гельминтологическое вскрытие и неполное.

l l Полное гельминтологическое вскрытие по К. И. Скрябину – наиболее надежный метод, позволяющий производить полный количественный и качественный учет всех гельминтов, которыми инвазировано животное. Данный метод заключается в следующем: после снятия с трупа кожи тщательно осматривают подкожную клетчатку, затем вскрываю грудную и брюшную полости и извлекают все внутренние органы.

l l Органы каждой системы – пищеварительной, дыхательной, кровеносной, мочеполовой и др. – препарируют и исследуют отдельно. Все трубчатые органы вскрывают по их длине, содержимое помещают в таз, ведро или банку (в зависимости от объема органа); со слизистых оболочек делают соскоб, а стенку вскрытого органа (иногда) просматривают под компрессориумом.

l Паренхиматозные органы – печень, легкие, поджелудочную железу, почки и др. – помещают в отдельную посуду и превращают в детрит (фарш), разрывая руками или разрезая их на мелкие кусочки ножом и ножницами. Детрит, соскобы, содержимое органов отмывают водой или физиологическим раствором, пользуясь методом последовательных смывов. Полученные материала (осадки) изучают небольшими порциями сначала в черных, затем в белых кюветах или в чашках Петри на черном и белом фоне.

l Крупные гельминты отбирают визуально, а мелкие – при помощи лупы с 8 -10 -кратным увеличением. Собирают гельминты только кисточками или препаровальными иглами, но не пинцетом и не пальцами.

l l l Полное гельминтологическое исследование отдельных органов проводят в том случае, если необходимо иметь точные данные о местонахождении того или иного гельминта. Например, при фасциолезе исследуют только печень, при диктиокаулезе – легкие, при дрепанидотениозе – тонкий отдел кишечника и т. д. Этот метод более практичен, прост и достаточно точен.

Неполное гельминтологическое вскрытие l l Неполное гельминтологическое вскрытие – это упрощенное гельминтологическое вскрытие, в процессе которого извлекают из органов и тканей лишь отдельные, резко выделяющиеся по размерам гельминты. Такое вскрытие имеет большое значение как для диагностики гельминтозов, так для получения музейного материала.

l l Лабораторные методы диагностики гельминтозов. Основные макроскопические и микроскопические методы лабораторной диагностики гельминтозов

l l Для обнаружения гельминтов, их фрагментов (члеников, головок, обрывков стробилы), личинок и яиц исследуют: кал, мочу, мокроту, ректальную и перианальную слизь, кровь.

l l l Методы гельминтологических исследований делятся на две группы: прямые косвенные.

l Прямые – выявление как самих гельминтов и их фрагментов, так и продуктов размножения. Исследования фекалий, мочи, перианальной слизи, мокроты, носовой слизи.

l Косвенные методы – выявляют вторичные изменения, возникающие в организме человека в результате жизнедеятельности паразита. Сюда относятся серологические и аллергические реакции, общие исследования крови.

Капрологический метод 1. . Копрологическое исследование – исследование кала является наиболее распространенным, т. к. большая часть гельминтов паразитирует у человека в кишечнике или органах, с ним связанных, а их яйца выделяются вместе с испражнениями.

Осмотр фекалий проводят: l l Макроскопическим методом Методом отстаивания

Макроскопический. l l l Небольшие порции кала перемешивают с водой в плоской ванночке или чашке Петри и, просматривая при хорошем освещении на темном фоне (при необходимости пользоваться лупой) извлекают гельминтов и все подозрительные белые образования пинцетом или пипеткой переносят на предметное стекло в каплю разведенного глицерина или изотонического раствора хлорида натрия для дальнейшего изучения

Метод отстаивания. l l Всю исследуемую порцию фекалий нужно размешать с водой в стеклянном цилиндре или горшке затем осторожно слить верхний слой отстаиваемой жидкости повторяют несколько раз После того как жидкость станет прозрачной, ее сливают, а осадок просматривают небольшими порциями в стеклянной ванночке или чашке Петри.

Микроскопия испражнений l l l Микроскопия – основной метод исследования фекалий для обнаружения яиц или личинок гельминтов. Испражнения для анализа должны быть доставлены не позже суток после их выделения. Для повышения достоверности исследования анализы нужно повторить несколько раз ежедневно или с промежутками в 1 -3 дня.

Нативный мазок (1853 г. Давэн) l l l Небольшой кусочек кала переносят палочкой на предметное стекло в каплю 50% водного раствора глицерина (для его получения смешивают ровное количество воды и чистого глицерина) растирают до получения равномерного прозрачного мазка (два препарата). Всего просматривают не менее 2 стекол, т. е. 4 препарата.

Модификация - Березанцев и Автушенко (1973) l l большой мазок 200 -300 мг кала, величиной с крупную горошину, растирают на стекло 6 Х 9 см в 15 -20 каплях 50% водного глицерина Мазок просматривают под бинокулярным стереоскопическим микроскопом в проходящем свете без покровных стекол: х17, х2 или х12, 5 и х4. При таком увеличении хорошо обнаруживаются окрашенные крупные яйца гельминтов.

l l Для обнаружения мелких яиц трематод этот метод непригоден. Большой объем исследуемого материала и большое поле зрения при высокой глубине резкости обеспечивают значительную эффективность указанной модификации по сравнению с обычными нативными мазками.

Толстый мазок с целлофаном (метод Като) l Принцип метода: яйца гельминтов обнаруживают в толстом мазке кала, просветленного глицерином и подкрашенного малахитовой зеленью.

l l Предварительно гидрофильный целлофан толщиной 22 мкм нарезают пластинками с размером сторон 20 х40 мм и погружают на сутки в раствор: 6 мл 3% водного раствора малахитовой зелени, 500 мл глицерина и 500 мл 6% водного раствора фенола. В 3 -5 мл указанной смеси можно обработать 100 пластинок, которые в этом же растворе можно хранить в хорошо закрытом сосуде. При приготовлении необходимо следить, чтобы пластинки плотно не прилегали друг к другу.

Ход исследования l 100 мг фекалий (размером с горошину) наносят на предметное стекло, покрывают обработанной глицерином пластинкой (глицерин должен стечь) целлофана и придавливают резиновой пробкой, так, чтобы фекалии не растеклись из-под целлофана.

l Исследование при малом или среднем увеличении микроскопа необходимо проводить не позже чем через час после приготовления мазка, а в жаркую погоду через 30 -40 мин. Чрезмерное высыхание препарата и длительное просветляющее действие глицерина затрудняют микроскопию.

l l Метод Като позволяет исследовать большой объем фекалий с большей эффективностью, чем при обычном нативном мазке. Можно выявить аскарид, власоглавов, лентецов, трематод, тениид, однако для обнаружения яиц анкилостомид и карликового цепня, особенно при малой интенсивности инвазий он малоэффективен.

Метод закручивания по Шульману l l В небольшой баночке 2 -3 г фекалий заливают 5 кратным количеством воды и стеклянной палочкой очень быстро размешивают, стараясь не задевать стенки баночки. Затем палочку быстро вынимают и образовавшуюся на ее конце каплю жидкости переносят на предметное стекло для микроскопирования.

Метод Бермана l. Основан на способности личинок мигрировать по направлению к теплу и служит для выявления в фекалиях личинок гельминтов (стронгилоидоз). l 5 -10 г исследованных фекалий на мелкоячеистую металлическую сетку в стеклянную воронку, закрепленную на штативе.

l l На узкий конец воронки надевают резиновую трубку с зажимом. Воронку заполняют нагретой до 50°С водой так, чтобы нижняя часть сетки была в нее погружена. личинки из фекалий переходят в воду и скапливаются в нижнем конце трубки. Открыв через 4 ч зажим, собирают личинок в центрифужные пробирки, центрифугируют 2 -3 мин и микроскопируют осадок.

Методы обогащения (метод Фюлленборна и метод Калактарян) l l основан на всплывании яиц многих видов гельминтов в растворе высокой относительной плотности дает возможность выявления яиц даже при небольшом их количестве.

Метод Фюлленборна l l Предварительно готовят насыщенный раствор поваренной соли (400 г в 1 л воды при кипении). Хранить в закрытой бутыли. Для проведения анализа в баночку (объемом 3050 мл) помещают 2 -3 г фекалий и при помешивании палочкой доливают доверху насыщенным раствором соли.

l l l Полоской бумаги тут же снимают всплывшие крупные частицы. Через 45 -60 мин проволочной петлей снимают поверхностную пленку и стряхивают ее на предметное стекло в каплю 50% водного раствора глицерина (4 препарата на двух стеклах). Проволочную петлю после каждого анализа прижигают на спиртовке.

Можно сверху на баночку поместить предметное стекло так, чтобы оно соприкасалось с поверхностью раствора. l Всплывающие яйца гельминтов прикасаются к поверхности стекла, которое через 45 -60 мин после отстаивания быстро снимают, переворачивают, помещают на более крупное стекло (чтобы не запачкать столик микроскопа) и исследуют. l Дополнительно просматривают осадок. l

Метод Калантарян l l l Отличается тем, что для приготовления насыщенного раствора применяют азотнокислый натрий. Осадок исследовать не надо, т. к. всплывают все яйца, но дорогой препарат. Отстаивать 20 -30 мин

Метод Красильникова ( 1970) l l основан на применении детергентов, т. е. под действием поверхностно-активных веществ, входящих в состав моющих средств (детергентов), яйца гельминтов освобождаются от фекальных масс и концентрируются в осадке. Для сохранения фекалий и содержащихся в них яиц гельминтов на длительный срок применяют консерванты (детергенты)

l l 1 г фекалий заливают 5 -кратным объемом одного из указанных растворов (1% раствор «Лотоса» /яйца и личинки гельминтов сохраняют не менее 6 мес. ) При необходимости сохранить препарат, приготовленный на предметном стекле в 50% растворе глицерина, его накрывают покровным стеклом, края которого склеивают конторским клеем и подсушивают 2 ч

ИССЛЕДОВАНИЯ МЕТОДОМ СОСКОБА. для выявления яиц остриц и бычьего цепня. l l Соскоб с перианальных складок Небольшой деревянной палочкой или спичкой с тугонамотанным на конце ватным тампончиком, смоченным 50% раствором глицерина, осторожно производят соскобливание с перианальных складок. Затем палочку с тампоном помещают в сухую небольшую пробирку или на предметное стекло, закрепив резиновым кольцом. В лаборатории тампон смывают поочередно в 4 каплях 50% раствора глицерина, помещенные на двух предметных стеклах и микроскопируют.

Соскоб с применением деревянного шпателя l l l Соскоб делают утром, до дефекации (у женщие до мочеиспускания) или вечером через 2 -3 ч после того, как пациент лег спать. Соскабливание проводят осторожно с поверхности складок в окружении ануса и в нижних отделах прямой кишки деревянным шпателем, смоченным в 50% растворе глицерина или 1% растворе гидрокарбоната натрия. Полученный материал, тщательно очищенный со шпателя краем покровного стекла, помещают на предметное стекло в каплю того раствора, покрывают тем же стеклом и исследуют. Шпатель сжигают.

Метод липкой ленты (по Грехему) l l l В последнее время получают все большое распространение способ липкой ленты. Кусок ленты длиной 6 -8 см прикладывают к перианальной области обследуемого затем липкой стороной накладывают на предметное стекло.

l Исследование желчи, мокроты, мочи, крови, мышц.

Исследование мышц (биопсия). l l l Мышцы разрезают на очень мелкие кусочки и помещают между двумя толстыми стеклами, раздавливая немного волокна. лучше просматривать в специальном компрессории микроскопа – трихинеллоскопа.

l l Компрессорий представляет собой два широких толстых стекла, скрепленных по тылу пресса двумя винтами. Волокна в нем располагаются тонким слоем и хорошо просвечивают при исследовании под малым увеличением микроскопа. Личинок трихинелл обнаруживают в виде спирально свернутых червячков, находящихся в лимонообразных или округлых капсул внутри мышечных волокон.

метод переваривания мышц. l l мелко измельченные мышцы заливают 15 -20 кратным количеством искусственного желудочного сока Помещают смесь в термостат при температуре 37ºС на 12 -16 ч. микроскопируют осадок личинки в свободном состоянии выявляют среди массы остатков переваренных мышечных волокон.

Исследование объектов внешней среды на зараженность гельминтами Для изучения некоторых вопросов эпидемиологии гельминтозов. l При оценке эффективности рациональных методов обезвреживания нечистот и сточных вод на очистных сооружениях различных типов.

l l Для текущего санитарного контроля за содержанием детских, пищевых, лечебных, оздоровительных и других учреждений. анализы воды, почвы, овощей, различных предметов проводят с целью определения их роли в передаче яиц гельминтов и в заражении человека, степени загрязненности внешней среды выбора необходимости профилактических мероприятий.

l l В зависимости от конкретных условиях пробы для исследования можно брать в различном объеме. на одну пробу рекомендуется брать 10 -15 л речной или колодезной и всего лишь 1 -3 л сточной воды.

l l Однако с целью последующего сравнения между собой полученные данные необходимо пересчитывать на стандартные показатели. Например, число яиц гельминтов, полученное в результате анализа пробы, пересчитывают на 1 кг зелени (овощей), 1 кг почвы или 1 л воды в зависимости от исследованного материала.

Исследование воды l l Количество воды, взятой для анализа, должно быть тем больше, чем крупнее исследуемый водоем и чем прозрачнее вода. Пробу рекомендуется забирать не всю сразу, а по 0, 5 л через каждые 5 -10 мин примерно в течение часа (если обследуется проточный водоем).

l Дробный метод составления средних проб повышает вероятность обнаружения яиц гельминтов и позволяет более обоснованно оценивать полученные + или – результаты лабораторного исследования.

Исследования почвы. l l Почву для анализа берут в зависимости от цели исследования в различных местах: на индивидуальных или общественных огородах, полях орошения, территорий усадеб, детских учреждений, рынков, мест игр детей, на животноводческих фермах, в местах проживания работников животноводства и т. д. методические правила: После общего санитарного обследования участка намечают конкретные места для взятки проб, практически такие, где можно ожидать наличие яиц гельминтов. На территории детского учреждения это будут игровые площадки, песочницы, участки возле заборов, уборных и мусорных ящиков.

l l l Во дворе жилого дома это участки вблизи сараев, забора, уборных и места сбора нечистот и мусора, место хранения корма для скота. Почву на усадьбах берут также с огородов, сада или газонов. На рынках пробы отбирают из-под прилавков, на которых ведется торговля овощами и зеленью. После того как уточнены места приступают к сбору образцов почвы. Землю берут как с поверхности, так и на глубине 2 -3 см, а на огородах, в садах и полях орошения с 10 и 20 см. При обследовании игровых площадок, компостов глубина взятия пробы может достигать 1 -2 м.

l l Рекомендуется с каждого однотысячного участка ( «точки обследования» ) почву собирать в 5 -10 различных местах навесками по 10 -15 г, объединяя все в одну пробу общей массой 150200 г, причем составляется общая проба с поверхности, общая – с глубины 2 -3 см и т. д. На территории одного объекта берут 10 проб. Землю с поверхности собирают ложкой, совочком, с большей глубины – лопаткой или буром.

l l l Пробу помещают в плотно закрытую стеклянную посуду или полиэтиленовые пакеты. Внутрь вкладывают этикетку с указанием даты и объекта обследования, места взятия пробы, глубины, условий участка (открытое место, в тени, участок закрыт растительностью и др. ). Пробы, доставленные в лабораторию, желательно исследовать, не откладывая, т. к. яйца ряда гельминтов быстро разрушаются, погибают личинки. Хранить пробы рекомендуется в холодильнике (+5°С) не более месяца.

Исследования овощей, ягод, фруктов и зелени. l l l Исследованию подвергают овощи, собранные на индивидуальных и общественных огородах, на полях орошения. Пробы отбирают также на рынках, в магазинах, пищеблоках столовых. На одну пробу берут 0, 5 – 1 кг овощей (ягод, фруктов) или 100 -200 г зелени, заливают водой в стеклянной банке и оставляют на несколько часов или до следующего дня. После этого тщательно встряхивают в течение 10 -15 мин вручную или на специальном аппарате. При тонком слое земли на овощах их можно протереть жесткой щеткой в этой же банке. Удалив овощи, смывную воду с осадком переливают в стеклянный цилиндр, отстаивают в течение часа. Осадок исследуют, как почву, а промывную воду – как сточную.

Смывы с предметов и рук. l l С целью изучения степени загрязненности яйцами гельминтов предметов внешней среды берут смывы с пола, подоконников, ручек дверей в комнатах и уборных, кранов, умывальников, столов, стульев и т. д. Список предметов, подлежащих обследованию, определяется во время санитарного обследования объекта.

l l Берут не менее 10 -20 проб. Смыв с предметов и рук проводят кисточками или ватными тампонами, покрытыми капроновой тканью и предварительно увлажненными в 2% растворе гидрокарбоната натрия или 10 -20% растворе глицерина. Тампоном тщательно снимают с поверхности исследуемого предмета пыль и грязь, затем помещают в пробирку с тем же раствором и доставляют в лабораторию. Здесь тампон обмывают и отжимают в пробирке, жидкость центрифугируют и осадок микроскопируют.

Подногтевой соскоб l l l Соскоб можно брать отточенной спичкой или ватным тампоном, навернутым на спичку и смоченным 1% раствором едкого натра или 50% водным раствором глицерина. Глицерин предпочтительнее при массовых обследованиях, т. к. взятый материал долго не высыхает. В лаборатории тампоны обмывают на предметном стекле в капле водного глицерина и полученные препараты микроскопируются.

l l l Исследование пыли с предметов предложено проводить с помощью электропылесоса, к которому при помощи резиновой трубки вместо обычного шланга со щетками присоединяют специальную воронку с пористой пластиной. На нее накладывают предварительно мембранный фильтр. Сбор пыли занимает 3 мин на каждую пробу. Затем фильтр извлекают и заменяют новым. Исследуют просветленные фильтры и пыль с как, соскобленную на предметное стекло. Метод эффективнее, чем с помощью тампонов, но дефицит фильтров ограничивает практическое использование.

Использование мух l l Известно, что мухи способны механически переносить на покровах своего тела и в кишечнике яйца многих видов гельминтов и цисты простейших. Поэтому возникает необходимость исследования мух в очагах гельминтов как одного из возможных факторов в распространении инвазий. Мух отлавливают в жилых и производственных помещениях, детских и пищевых учреждениях, на открытом воздухе и т. д.

l l Замаривают эфиром, помещают в пробирку (по 10 экз. ). В лаборатории с целью повышения смачиваемости мух заливают 70° спиртом на 30 мин, затем спирт сливают и заменяют изотоническим раствором хлорида натрия или дистиллированной водой. Пробирки помещают в аппарат для встряхивания на 10 мин). После извлечения мух жидкость центрифугируют 10 мин при 1500 об/мин. Осадок исследуют под микроскопом.

l Более упрощенным и менее эффективным методом является прямая микроскопия на предметном стекле в капле водного раствора глицерина отдельных частей свежеотловленных мух (лапки, крылья). Туловище мухи обмывают и исследуют. Исследуют и кишечник мухи.