Методы банкирования пуповинной крови Пуповинная кровь это

Методы банкирования пуповинной крови Пуповинная кровь – это часть крови плода, которая остается в сосудах плаценты и пупочного канатика после рождения ребенка.

The Eurocord Office Hopital Saint-Louis, Paris Элиан Глюкман 1989 г. — первая в мире трансплантация ГСК пуповинной крови 6 -летнему ребенку с анемией Фанкони. На сегодня - > 20 000 трансплантаций.

Банкирование пуповинной крови – это совокупность процессов сбора, обработки, тестирований и криохранения биоматериала.

Соотношение клеточных компонентов ПК • Эритроциты ~ 28, 5% • Лейкоциты (ядросодержащие клетки, ЯСК) ~ 71, 5% o Лимфоциты ~ 76, 5% (от ЯСК) o CD 34+ ~ 1% (от ЯСК) Средние количества клеток в образце ПК (80 -100 мл) • ЯСК – 0, 5 -1, 5 x 10*9 • CD 34+ -- 0, 1 -12 x 10*6 • КОЕ-ГМ – 2 -40 x 10*4

Минимально требования при банкировании пуповинной крови, согласно стандартам GMP • скрининг здоровья матерей; • получение добровольного информированного согласия матери; • сбор и транспортировка пуповинной крови; • обработка, криоконсервация, хранение и мониторинг образцов пуповинной крови; • маркировка и этикирование на всех этапах работы; • тестирование на стерильность, иммуногенетику; • извещения в случае обнаружения возбудителей гемотрансмиссивных инфекций в соответствии с законодательством.

Основные этапы банкирования пуповинной крови 1. Получение информированного согласия матери на сбор пуповинной крови; 2. Сбор пуповинной крови; 3. Подготовка образца к хранению. Основные задачи при заготовке пуповинной крови • Сбор максимального объёма пуповинной крови; • Максимальное выделение ядросодержащих клеток (ЯСК, лейкацитарная фракция); • Сохранение жизнеспособности ГСК на вех этапах обработки.

Получение информированного согласия Yes! Набор для забора ПК: ·Бетадин – 30 мл · «Гемакон» - 1 шт. ·Салфетки стерильные – 3 шт. ·Шапочка врачебная нетканая – 3 шт. ·Маска медицинская одноразовая – 3 шт. ·Перчатки стерильные – 2 шт.

Способы забора пуповинной крови

Закрытые системы, используемые для забора пуповинной крови

Гемоконсерванты крови: • ЦФДА-1(CPDA-1) • ЦФГ • Цитроглюкофосфат • Цитрат натрия • Глюгицир • Фаглюцид и др.

Закрытый способ сбора эксфузия крови в закрытый контейнер Средний объём образца = 76, 4 ± 32, 1 мл Средняя концентрация ЯСК = 10, 5 ± 3, 6 х 10*6/мл Вероятность инфицирования – 3, 3% Открытый способ сбора активная эксфузия крови шприцами с дальнейшем промыванием вен плаценты и дренированием крови в контейнер Средний объём образца = 174, 4 ± 42, 8 мл Средняя концентрация ЯСК = 8, 8 ± 3, 4 х 10*6/мл Вероятность инфицирования – 12, 5 -30% !!!

Интраутеральный (in utero) метод сбора ПК Пока плацента находится в матке: пункция пупочной вены иголкой, соединенной с мешком с антикоагулянтом, в который под действием гравитационной силы поступает кровь.

Экстраутеральный (ex utero) метод сбора ПК В случае преждевременного отхождения плаценты: сбор подобен интраутеральному методу.

Сравнительная оценка методов cбора ПК (по Абукадыров К. М. с соавт. )

Факторы способствующие эффективному сбору ПК Время забора – чем раньше начать сбор ПК после рождения, тем больший объём ПК будет собран (до 1 -3 мин) Время родов – наибольший объём ПК получают, если роды были ближе к 40 неделе беременности Возраст матери – у матерей возрастом 20 -37 лет получают наибольший объём ПК Способ родов – при естественных родах ребёнок испытывает родовой стресс, в результате чего в ПК попадает дополнительное количество лейкоцитов Время хранения ПК до обработки – 24 -48 часов при +4 -22 °С (чем дольше хранение, тем меньше практический выход ГСК) Чем больше объём ПК – тем больше количество ГСК !

Выделение лейкоцитарной фракции (ЯСК) из ПК

Аппаратный метод выделения Optipress II Compomat G 4 полуавтоматическая система автоматический сепаратор

Biosafe – Sepax (автоматический сепаратор)

Криопакет с дозой ПК, выделенного машинным способом Состав криопротектора: 10% DMSO 1% Dextran (полисахарид) 40% Hespan (гидроксиэтиловый крахмал) Клетки: Лейкоконцентрат с Эритроцитами (50% объёма)

Ручной метод выделения Этапы выделения ПК: 1) седиментация желатином, или гидроксиэтилкрахмалом, или полиглюкином; 2) фракционирование центрифугированием

Плазмоэкстрактор

Выделение лейкоцитарной фракции пуповинной крови при помощи препарата «Гелофузин» (4% модифицированный жидкий желатин)

17 мин. 35 мин. 22 мин. 40 мин. 27 мин.

После экстракции плазмы ЯСК в 1 мл. – 2, 8 х 10*7 ЯСК в пакете с эритроцитами – 2, 3 х 10*6 «Эффективность» выделения – 91, 8 %

Содержание ГСК (CD 34+) в лейкоконцентрате Абсолютное количество ЯСК – 1, 5 х 10*9 CD 34+ 2, 6 х 10*7

Криопробирки с дозой ПК, выделенного ручным способом Состав криопротектора: 10% DMSO 40% Гелофузин (жидкий желатин) Клетки: Лейкоконцентрат с Эритроцитами в автосыворотке (50% объёма)

Лабораторный скрининг ПК на инфекции (гепатит В) (сифилис) По данным Тюмина О. В. , г. Самара (гепатит С) По данным банков ПК США и ЕС около 5 -7% образцов ПК не стерильны (в результате нарушения процедуры забора ПК)

Объём образца ПК для криопрезервации Нет единого стандарта! США: National Marrow Donor Program – 40 ml Lifebank USA – 35 ml Sibling Cord Blood Program – 20 ml Viacird, Stem. Cyte – 10 ml Франция: хранение цельной крови без предварительной лейкоконцентрации

Банки пуповинной крови В мире более 100 общественных (~ 400 тыс образцов) и более 130 частных (~ 800 тыс образцов) банков пуповинной крови

Первый государственный банк ПК – New York Blood Center (NYBC, 1988). Директор – Пабло Рубинштейн Первый в мире частный банк ПК – 1992, США. Директор – Дэвид Харрис.

Области применения ГСК в клинике Миелопролиферативные заболевания Миелофиброз и др. Гемабластозы Острая/хроническая миелоидная лейкемия; B-клеточная лимфома и др. Анемии Апластическая анемия; Серповидно-клеточная анемия; Талассемия и др. ВИЧ/СПИД Формирование ВИЧ-толерантного статуса ГСК Аутоиммунные заболевания Рассеянный склероз и др. Острые ишемические процессы Инфаркт миокарда; Инсульт; Острая ишемия нижних конечностей и др. Генотерапия Β-талассемия; X-сцепленный тяжёлый комбинированный иммунодефицит и др.

Расчёт эффективной дозы препарата пуповинной крови (2 млн ЯСК/кг) Количество ЯСК Масса пациента (кг) Недостатки пуповинной крови как источника ГСК 1) Малое количество ГСК, получаемое при заготовке; 2) Невозможность повторного забора.

Гемакорд (Hemacord™) – первый продукт ПК, одобренный Управлением по контролю над продуктами и лекарствами в США. Представляет собой совокупный продукт из определенного количества криоконсервированных образцов ПК. Показан при трансплантациях в качестве неродственных донорских гемопоэтических клеток у пациентов с врожденными/приобретенными нарушениями кроветворения.

Организации и директивы, устанавливающие стандарты качества для хранения крови Международные, ЕС, США 2004/23/ЕС – директива Евросоюза, устанавливающая стандарты качества и безопасности донорства, получения, тестирования, обработки, хранения и распределения человеческих клеток и тканей. FACT – Foundation for the Accreditation of Cellular Therapy. AABB – American Association of Blood Banks. Standards for Hemapoetic Progenitor Cell Services. International Standards for Cord Blood Collection, Processing, Testing, Banking, Selection and Release – регламентирует все процедуры, проводимые с образцом пуповинной крови (взятие крови, тестирование, обработка, криохранение).

Организации и директивы, устанавливающие стандарты качества для хранения крови Украина Приказ Минздрава № 325 от 25 июля 2003 г. требования и нормы для банков пуповинной крови. ГОСТ-Р 52249 -2004 – «Правила производства и качества лекарственных средств» . Закон України “Про трансплантацію органів та інших анатомічних матеріалів людини”.