Методы анализа нуклеиновых кислот Подготовка НК к

Методы анализа нуклеиновых кислот

Подготовка НК к анализу 1. С помощью ферментов рестриктаз ДНК разрезают на фрагменты Рестриктазы или рестрицирующие эндонуклеазы – высокоспецифичные ферменты, узнающие строго определенные последовательности ДНК и разрезающие их.

Рестриктазы распознают палиндромы –последовательности- перевертыши, идентичные в обеих цепях при прочтении в направлении 5’ – 3’. «шалаш» «а роза упала на лапу азора»

2. Проводят амплификацию (получение большого количества копий) фрагментов ДНК: n n n Полученные фрагменты ДНК подвергают денатурации (90°С) –разрыв водородных связей и разделение цепей; Вносят праймер и проводят его фиксацию (отжиг); Добавляют НТФ и ДНК-полимеразу

ПЦР (полимеразная цепная реакция) Kary Mullis (р. 1944) Нобелевская премия по химии 1993

ПЦР – это способ получения достаточного для анализа числа копий ДНК (гена или его фрагмента) В пробирке смешиваются: исследуемый материал (образец ДНК), д. НТФ (субстраты для синтеза), ДНК-полимераза (Taqполимераза), праймеры ТЕРМОЦИКЛЕР 1. Нагревание до 900 С (денатурация ДНК) 2. Охлаждение до 550 С ( «отжиг» праймеров) 3. Нагревание до 750 С (удвоение цепей) повторение цикла

ПЦР Применение: • Диагностика бактериальных и вирусных инфекций • Генетическое типирование (определение носительства мутантных генов)

Исследование последовательности нуклеотидов ДНК (метод Сэнджера) Основан на ДНК-полимеразной реакции. Реакцию проводят в 4 -х пробирках, в каждую из которых вносится: § матрица (исследуемый фрагмент ДНК) § праймер § субстраты (д. АТФ*р/а, д. ГТФ, д. ЦТФ, д. ТТФ) § ДНК-полимераза § один из четырех видов дидезоксинуклеотидов (дд. АТФ, дд. ГТФ, дд. ЦТФ, дд. ТТФ)

После включения дидезоксинуклеотида в растущую цепь ДНК ее синтез останавливается НО – СН 2 3’ ОН О НО – СН 2 2’ ОН рибоза 3’ ОН О НО – СН 2 2’ Н дезоксирибоза 3’ Н О 2’ Н дидезоксирибоза

матрица 3’ ААТТГ -----Ц----------Ц-----5’ ТТААЦ -----Г дд. ГТФ, д. ГТФ и др. матрица 3’ ААТТГ -----Ц----------Ц-----5’ ТТААЦ -----Г-----------Г

Стандартный генетический код

Саузерн- и Нозерн-блоттинг Методы основаны на способности ДНК и РНК образовывать гибриды ДНК – ДНК; ДНК – РНК; РНК-РНК Саузерн-блот – для идентификации ДНК; Нозерн-блот – для определения РНК Эдвин Саузерн изобрел этот метод Принципы блоттинга такие же, как и в случае Вестерн-блота

Блот-анализ ДНК (Саузерн-блот) – позволяет проводить диагностику наследственных заболеваний путем поиска в геноме дефектных генов, отвечающих за их развитие. При проведении Блот-анализа ДНК используют зонд - одноцепочечную ДНК, комплементарную искомой и меченую радиоактивным фосфором P 32. Этапы постановки блот-анализа ДНК: 1) экстракция ДНК 2) разрезание ДНК рестриктазами 3) разделение ДНК путем электрофореза в агарозном геле по молекулярной массе

Саузерн-блот метод «отпечатков пальцев» ДНК используется для: 1) идентификации личности в судебной медицине 2) комплексной диагностики наследственных заболеваний и поиске участков ДНК, отвечающих за развитие патологии 4) установления отцовства

Нозерн-блот (англ. Northern blot) — метод исследования экспрессии генов путём тестирования молекул РНК (м. РНК) и их фрагментов в образцах. Основным отличием метода нозерн-блот от Саузерн-блот является то, что определяемым субстратом является не ДНК, а РНК. Это обуславливает различия в методике — вместо нитроцеллюлозного используется фильтр из диазобензилоксиметил-целлюлозы, в качестве зондов используют комплементарные молекулы ДНК и т. д.

Нозерн-блот (для определения РНК)

Этапы блоттинга : n n n Выделение НК из биологического материала, фрагментация Электрофорез Прикрепление НК-мишени к подложке (нитроцеллюлоза, найлон) n Денатурация и фиксация Гибридизация с молекулярным зондом n Авторадиография n (меченый Р* образец ожидаемой (искомой) ДНК)

Прикладное значение: Это метод «отпечатков пальцев» n идентификация людей; n диагностика наследственных заболеваний; n наиболее быстрый путь сравнения последовательности нуклеотидов в составе ДНК живых организмов

ВЕСТЕРН-БЛОТ (иммуноэлектрофорез) В основе метода – принцип комплементарности