Методология проведения химико-токсикологического анализа 1 Химико-токсикологический анализ

Методология проведения химико-токсикологического анализа 1

Химико-токсикологический анализ (ХТА) – это обнаружение и количественное определение ТВ и их метаболитов в биопробах живых лиц, в трупном материале и в иных объектах ( «вещественные доказательства отравления» ) 2

Основные вопросы, решаемые при ХТА - наличие ТВ в объекте исследования - количество ТВ Задачи ХТА - обнаружение ТВ - количественное определение ТВ в объекте исследования с применением химических, физико-химических, физических, биологических и др. методов анализа 3

Несоблюдение условий ХТА • Отбора, транспортировки и хранения проб • Методик изолирования, обнаружения, количественного определения ü может привести к появлению ложных результатов 4

• ложно отрицательный результат – вещество в пробе есть, но оно не обнаружено • ложно положительный результат – вещества в пробе нет, но оно «обнаружено» (обнаружено вещество похожее на искомое, неправильно интерпретированы результаты, …) ü Достоверность отрицательных результатов ХТА около 70%, положительных – около 90% 5

Надежность результатов зависит от • Правильного выбора объектов • Соблюдения требований к отбору проб (время, консервация и др. ) • Своевременности проведения исследования 6

Заключение ХТА, не может содержать вывод о наличии / отсутствии искомого вещества в исследуемом объекте; утверждается факт его обнаружения либо необнаружения, а также приводится найденное его количество 7

В зависимости от определенности и диапазона исследования различают • Направленный ХТА – круг искомых веществ четко определен (конкретное вещество, несколько конкретных веществ, группа однородных веществ) • Ненаправленный ХТА – круг искомых веществ не определен (например, отравление неизвестным ядом) 8

• Направленный анализ – подтверждение наличия известного ТВ и его количественное определение • Ненаправленный анализ – скрининговая методика обнаружения Скрининговые методы обнаружения – позволяют в минимальное время из большого круга ТВ выделить одно-несколько веществ, на которые далее проводится целенаправленное исследование 9

Схема ХТА I. Подготовительный этап – отбор объектов II. Осмотр объектов и предварительные пробы III. Пробоподготовка (изолирование, очистка, концентрирование) IV. Собственно анализ 1. Обнаружение 2. Количественное определение V. Обработка результатов Постановка диагноза не входит в компетенцию химика! 10

Объекты ХТА • Биожидкости (моча, кровь, плазма, слюна, лимфа и др. ) • Органы и ткани (в т. ч. – волосы, ногти) • Небиологические образцы (остатки препарата, посуда, одежда, пищевые продукты и др. ) • Прочие (рвотные массы, смывы с поверхности кожи и др. ) 11

Отбор объектов не является этапом ХТА! ü НО от этого зависят результаты ХТА Необходимо обращать внимание на следующие моменты: • выбор «правильного» объекта (в котором наибольшая вероятность нахождения вещества) • соблюдение правил отбора • обеспечение сохранности вещества в объекте (отбор в специальные емкости, при необходимости консервация объекта) • соблюдение условий транспортировки и хранения объекта • предотвращение фальсификации образца • маркировка образцов 12 • документирование процедуры

Правила отбора объектов • Для ХТИ – Приказ МЗ РФ от 27. 01. 2006 N 40 «Об организации проведения ХТИ при аналитической диагностике наличия в организме человека алкоголя, наркотических средств, психотропных и других токсических веществ» • Для СХЭ – Приказ МЗ РФ № 346 от 12. 05. 10 «Об утверждении Порядка организации и производства судебно-медицинских экспертиз в государственных судебно-экспертных учреждениях РФ» ü Конкретными методиками могут быть установлены правила ВЫБОРА объектов для исследования на те или иные вещества 13

Несоблюдение правил отбора, документирования и другие нарушения процедуры лишают результаты экспертизы (исследования) ДОКАЗАТЕЛЬНОГО ЗНАЧЕНИЯ 14

15

16

17

18

Осмотр биообъектов при исследовании • Внешний вид, цвет, запах и др. • Инородные включения • Запах • Окраска стенок желудка • Цвет мочи • р. Н среды 19

Предварительные пробы • Позволяют ограничить круг исследования при ненаправленном анализе • Возможны не на все токсикологически значимые вещества • Проводятся непосредственно с биологическим материалом (до изолирования) • Являются чувствительными, но не специфичными 20

Примеры предварительных проб с мочой • Барбитураты – тест с кобальтовой бумагой • Производные ПАБК – реакция образования азокрасителя • Фенотиазины – FPN-реактив • Производные пиразола – проба с хлоридом железа (III) 21

Этап пробоподготовки • Цель пробоподготовки – приведение вещества в состояние, необходимое для проведения анализа • Задачи пробоподготовки – изолирование вещества, очистка и концентрирование пробы • От этого зависит полнота выделения искомого вещества из объекта (вещество не должно подвергаться химическим изменениям) • Методы – экстракция, дистилляция, сорбция, минерализация и др. 22

Процесс пробоподготовки • Измельчение твердого объекта • Лиофилизация (обезвоживание) • Депротеинирование (удаление белков) • Удаление липидов • Гидролиз коньюгатов (при необходимости) 23

• Метод анализа – теоретически обоснованный способ определения химического состава, принцип определения этого состава на основании исследования и/или измерения сигнала в широком смысле слова • Методика анализа – подробное описание выполнения анализа конкретного объекта избранным методом применительно к данному объекту 24

Методы обнаружения I. Предварительные испытания • Могут иметь отрицательное судебно-химическое значение (в случае «отрицательного» результата дальнейшее исследование на вещество или группу веществ не проводится) • Методы: цветные реакции, ТСХ, иммуноферментные методы II. Подтверждающие испытания • Проводят для подтверждения результата • Методы: инструментальные – хроматографические, спектральные и др. • Методы, используемые в качестве подтверждающих, могут являются методами количественного определения 25

Принципы структуры ХТА • Предварительные и подтверждающие испытания проводятся методами, основанными на разных принципах • Предварительные методы должны быть достаточно чувствительны, но не обязательно высоко специфичны; должны охватывать широкий круг ТВ • Подтверждающие методы должны быть выше или равными по чувствительности предварительным и более специфичными, чем предварительные • Результаты должны отличаться особой надежностью, т. к. имеют юридические последствия • Методы количественного определения должны быть апробированы на той биологической матрице, которая будет использоваться для анализа • Проводят не менее двух количественных определений 26 для каждого объекта

ХТА «вещественных доказательств» отравления ü Этап пробоподготовки отсутствует или содержит меньше операций, чем при исследовании объекта биологического происхождения 27

Жидкость неизвестного состава • Цвет, запах, р. Н, смешиваемость с водой (полярность), по возможности – плотность, показатель преломления • Обозначив круг исследования проводят идентификацию (конкретное вещество или принадлежность к группе) 28

Порошок неизвестного состава • Цвет, запах, степень дисперсности, растворимость в воде и в других растворителях (органических, растворах кислот, щелочей), р. Н водного раствора (для растворимых) • Прокаливание • Идентификация (цветные реакции, ТСХ) Таблетки • Внешний вид, в т. ч. маркировка • Если есть предположения – качественный анализ 29

КЛАССИФИКАЦИЯ ТВ В ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЙ ХИМИИ 1. Вещества, изолируемые из биологического материала путем перегонки с водяным паром – «летучие» органические вещества 2. Вещества, изолируемые из биологического материала настаиванием с подкисленной водой или с подкисленным этиловым спиртом – наркотические, психотропные и другие сильнодействующие вещества 3. Вещества, изолируемые из биологического материала настаиванием его с водой – минеральные кислоты, едкие щелочи и соли некоторых 30 минеральных кислот

4. Вещества, изолируемые из биологического материала настаиванием его с органическими растворителями – пестициды 5. Вещества, изолируемые минерализацией – «металлические яды» 6. Вещества, которые определяют непосредственно в биологическом материале без выделения из исследуемых объектов – оксид углерода (II) 31

«Модифицированная» классификация • Лекарственные вещества – изолирование путем настаивания с полярными растворителями (вода, спирт) • Летучие яды – изолирование перегонкой, парофазной экстракцией • Металлические яды – изолирование минерализацией • Ядохимикаты – настаивание с органическими растворителями • Фториды – деструкция с дистилляцией • Угарный газ – не требует изолирования 32

Использованы материалы • Токсикологическая химия: учебник для ВУЗОВ /под ред. Т. В. Плетеневой – М. : ГЭОТАР-Медиа, 2005 – 512 с. • Лекции Т. В. Плетеневой • Токсикологическая химия. Метаболизм и анализ токсикантов: учебное пособие /под ред. Н. И. Калетиной. ГЭОТАР-Медиа, 2008 – 1016 с. • Швайкова М. Д. Токсикологическая химия: учебник для ВУЗОВ. – М. : «Медицина» , 1975. – 376 с. • Крамаренко В. Ф. Токсикологическая химия: учебник для ВУЗОВ - М. : «Выша школа» , 1989 33