METODICHE DI CONCENTRAZIONE CELLULARE Luca Santoleri SIMT A

METODICHE DI CONCENTRAZIONE CELLULARE Luca Santoleri SIMT A. O. NIGUARDA CA’ GRANDA MILANO Novara, 14/12/2010

DISCLAIMER CONSULENTE SCIENTIFICO EON MEDICA Regen. Lab

Gel di piastrine ØIl gel di piastrine è un prodotto per uso topico costituito da piastrine, di origine autologa o allogenica, che miscelate con opportune soluzioni vengono attivate immediatamente prima dell’uso, a formare un “gel” che viene applicato laddove è necessario favorire un processo riparativo. ØIl razionale di impiego si basa sul fatto che le piastrine attivate liberano fattori paracrini, o esprimono molecole di membrana in grado di influenzare favorevolmente i processi riparativi.

Gel di piastrine in Ortopedia E’ possibile ottenere 2 prodotti diversi: • GEL PIASTRINICO: solo PRP (apporta solo GFs) Viene applicato nella sede dell’innesto osseo al momento della sua applicazione per attivare l’osteogenesi e favorirne l’integrazione. • BIOAUTOGLUE: PRP + crioprecipitato (> consistenza) Viene applicato nei casi in cui l’osso non sia in grado di ricevere l’impianto, e quindi debba essere preparato per un successivo intervento. Strada P - Il Servizio Trasfusionale, 2000 (Linee Guida SIMTI )

The use of autologous platelet gel to treat difficult-to-heal wounds: a pilot study (Mazzucco L et al, Transfusion, 2004) 53 patients enrolled • 22 had dehiscent sternal wounds (10 treated and 12 controls) • 31 had skin necrotic ulcers (17 treated and 14 controls)

Autologous platelet gel and fibrin sealant enhance the efficacy of total knee arthroplasty: improved range of motion, decreased length of stay and a reduced incidence of arthrofibrosis Everts et al, Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc 2007; 15: 888– 894 In patients in the treatment group the Hb concentration in blood decreased significantly less when compared to the control group (P < 0. 001). The patients showed a superior postoperative range of motion when compared to those of the control group (P < 0. 001). The incidence of arthrofibrosis and subsequent forced manipulation was significantly less (P < 0. 001) in patients managed with platelet gel and fibrin sealant.

COSA DICE LA LEGGE ? v Decreto 3 marzo 2005 “Caratteristiche e modalità per la donazione del sangue e di emocomponenti” v Raccomandazione n° R (95) 15 del Comitato dei Ministri agli Stati membri sulla Preparazione, Uso e Garanzia di Qualità degli Emocomponenti NO STANDARD DI PRODOTTO NE’ DI PROCESSO IL PARERE DELLA SIMTI “La produzione di emocomponenti per uso non trasfusionale, o topico, non risulta ancora adeguatamente standardizzata in relazione ad evidenze tecnico-scientifiche” Standard di Medicina Trasfusionale – Edizioni SIMTI 2007

Cosa dice la letteratura ?

Concentrazione piastrinica ottimale nel PRP v 2. 5 – 4. 5 x 106/μL (Linee Guida SIMTI, 2000) v 1 x 106/μL (Marx RE, J Oral Maxillofac Surg, 2004) v 1. 2 – 2. 0 x 106/μL (Borzini P, Transf Medicine, 2006) La conc. Pst e’ il vero parametro di qualita’ ?

Platelet count and GFs concentration (1) A linear increase of the growth factors PDGF-AB, TGF-, VEGF, and EGF with increased platelet number has been reported. Kevy SV, 27 th Annual Meeting of the Society for Biomaterials, St. Paul, Minn. , April 26, 2001. A direct proportionality was found between cell number and growth factor released only for PDGF, TGF-, and EGF. A correlation was not found for VEGF and IGF. Kevy S V, 5 th Annual Hilton Head Workshop on Engineering Tissue, Hilton Head, S. C. , February 23, 2001.

Platelet count and GFs concentration (2) v The growth factor content was not well correlated with the platelet count in whole blood nor with the prp (rp=0. 35). v No influence of gender or age on platelet count or growth factor concentrations was discovered (except IGF-I). Weibrich G, Journal of Cranio-Maxillofacial Surgery, 2002; 30: 97– 102

Platelet count and GFs concentration (3) Eppley BL, Plast Reconstr Surg 2004; 114: 1502 - 1508

Platelet count and GFs concentration (4) Advantageous biological effects seem to occur when PRP with a plt concentration of ≈ 1 x 106/µl is used. At lower concentrations, the effect is suboptimal, while higher concentrations might have a paradoxically inhibitory effect. Weibrich G, Bone 2004; 34: 665 - 671 The platelet growth factor content is quite variable among individuals and it is not necessarily proportional to the platelet count. Borzini P, Mazzucco L, Transfusion 2005 Weibrich G, Int J Oral Maxillofac Impants 2005

Factors affecting the relationship between Plt and GFs concentration (1) v Platelet v Wbc activation cell count v Plasma GFs contamination v Collection of GFs by fibrin clot To evaluate early alfa-granule release during PRP preparation P - selectin can be measured Eppley BL, Plast Reconstr Surg 2004; 114: 1502 - 1508

Factors affecting the relationship between Plt and GFs concentration (2) No correlation between plt and GFs concentration in PRP, because: v manipulation-induced plt stress; v variable susceptibility of plts to stress; v v microaggregates in PRP affecting an accurate platelet count; GF-absorbing proteins (fibrin monomers, thrombospondin released from plts during centrifugation) Mazzucco L, Vox Sang, 2009; 97 (2): 110 -8

Relationships among plt concentration, GFs concentration and clinical effectiveness is not clear. Manipulation of plts and way of gel activation were not given enough emphasis as variables relevant to GFs release from PRP-gels. Mazzucco L, Vox Sang, 2009; 97 (2): 110 -8

FDA APPROVAL Performance testing : § p. H § Count of RBC, WBC and plts in the WB and in PRP; § Evaluation of Platelet Recovery and Platelet Concentration Factor Specific tests for plts functionality: § P-selectin expression on platelets (on resting and ADP activated platelets) § Hypotonic stress response § Platelet aggregation (collagen)

SISTEMI PRODUTTIVI “HOME MADE” SISTEMI DELL’INDUSTRIA § APERTI § CHIUSI

GEL PIASTRINICO “HOME MADE” PRP DA AFERESI O DA FRAZIONAMENTO DI SANGUE INTERO (in sacca o in provetta) ATTIVATORE: TROMBINA prodotta dalla ricalcificazione di plasma anticoagulato o SALI DI CALCIO (gluconato o cloruro) VANTAGGI v Costi diretti < sistemi del commercio v v SVANTAGGI Logistica (cabina a flusso laminare, spazi dedicati) Tempi di lavorazione Risorse umane Difficoltà nello standardizzare i risultati

SISTEMI DELL’INDUSTRIA (1) Chiusi Vantaggi: v Rischio ridotto di contaminazione batterica v Semi - automatizzazione v Prodotto aliquotabile e congelabile v Standardizzazione del prodotto Svantaggi: v Costi diretti > “Home made” v Difficoltà nella produzione di piccoli volumi v Necessità di predeposito nel setting autologo Campo di applicazione: banking nel setting allogenico

Angel and the competition: S. W. O. T. Cytomedix, Angel q fully automated / 3 sensors q user independent / reproducable q adjust processing volume q “one-push button” q automatic separation of PPP, PRP and RBC q easy set-up q 40 – 180 ml of processed blood / cycle q maximal 3 cycles / disposable q PRP volume is 10% of the processed blood volume with a platelet count of 5 – 6 times baseline q Processing time is 28 min/180 blood q more flexible Strictly Confidential; for internal use only

SISTEMI DELL’INDUSTRIA (2) Ø Ø Ø Ø Ø Aperti Vantaggi: Prodotto “fresco” Non necessità di predeposito Possibilità di produrre anche piccoli volumi Standardizzazione delle caratteristiche del prodotto Svantaggi: Costi diretti > “Home made” Aumentato rischio di contaminazione batterica, se logistica inadeguata Difficoltà logistiche: sovrintendenza del SIMT Prodotto non sempre aliquotabile e congelabile Criticità: Variabilità, tra i diversi sistemi, nell’efficacia di produzione della trombina Campo di applicazione: setting autologo

Controlli di qualità Human plt counts using the GPS II concentration system Baseline PRP Average (x 103/μL) Fold Increase Percent Recovery Sample 1 (5 cc) 148 1605 10. 87 90. 6% Sample 2 (6 cc) 173 1680 9. 71 97. 1% Sample 3 (6 cc) 261 2251 8. 64 86. 4% Average 194 ± 59 1845 ± 353 9. 7 ± 1. 1 91. 2% ± 5. 5% Woodell-May JE, Journal of craniofacial surgery, Vol. 16, Number 5, September 2005

TAKE HOME MESSAGES v Importanza del sistema produttivo efficienza (piastrine, trombina) ü no plt stress ü Eseguire controlli di qualità v Eseguire test di sterilità v Adempiere alla normativa vigente v